超高效液相色谱-串联质谱法测定肉类中的6种糖皮质激素

王 跃

（哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江哈尔滨 150001）

0 引言

糖皮质激素，又名“肾上腺皮质激素”，是肾上腺皮质分泌的一类甾体激素，也可由化学方法人工合成，不仅具有抗菌消炎的作用，还具有调节糖类、蛋白质和脂肪的代谢作用。近年来，糖皮质激素在兽医临床上被广泛应用，并且临床用药量逐年增加，而其毒副作用常被忽视，滥用现象十分严重，长期大量使用会引起物质代谢紊乱和水盐代谢紊乱，出现类肾上腺皮质功能亢进综合征[1-3]。长期食用兽药残留的食品，会造成兽药在体内蓄积，当其浓度达到一定量时，会扰乱体内激素分泌、降低机体免疫力，造成肌肉萎缩无力、骨质疏松和生长迟缓等直接危害，而且还会出现发热、软弱无力、精神沉郁、食欲不振，血糖和血压下降等急性或慢性中毒症状[4-9]。因此建立有效、快速的方法检测禽畜肉类中的糖皮质激素的残留具有重大意义。

1 试验部分

1.1 仪器

T-QS型液相色谱-串联质谱仪，美国沃特世公司产品；XS-105型电子分析天平，瑞士梅特勒公司产品；XH-B型涡旋混合机，江苏康健医疗用品有限公司产品；HSC-12B型氮吹仪，天津恒奥科技公司产品；P-12型平行蒸发仪，瑞士步琦公司产品；固相萃取装置，美国安捷伦科技公司产品；KQ-100DE型超声清洗机，湖北生化科技设备公司产品；TG16-WS型离心机，湖北湘仪实验仪器开发有限公司产品；固相萃取柱，美国沃特世公司产品。

1.2 对照品及试剂试药

曲安西龙（批号100333-200201）、氢化可的松（批号 100152-200206）、地塞米松 （批号 100129-200804）、泼尼松（批号100199-201002）、泼尼松龙（批号100153-201004）、倍他米松（批号100118-200403），中国药品生物制品检定所提供；正己烷、丙酮、乙腈为质谱纯，德国Merck公司提供；水为超纯水，屈臣氏公司提供。

1.3 样品的制备

（1） 提取。称取样品2 g置50 mL离心管中，加入乙酸乙酯10 mL，涡旋提取3 min，然后以转速10 000 r/min离心10 min，取全部上清液。重复上述提取1次，合并乙酸乙酯层，于45℃下平行蒸发至近干。用乙酸乙酯-正己烷（1∶5）溶解残渣，待净化。

（2）净化。取待净化液过柱，用5 mL正己烷淋洗固相萃取柱，抽干，用正己烷-丙酮6/4洗脱，45℃氮气吹干，用初始梯度流动相1 mL溶解，过0.22 μm滤膜，进样。

1.4 标准溶液的制备

取6种糖皮质激素分别配制成质量浓度为10，20，50，100，200 ng/mL的标准曲线溶液。分别以每种物质的峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.5 液相色谱条件

色谱柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.40 mL/min；柱温40℃；进样量5 μL。

流动相A：5 mmol/L甲酸铵；流动相B：乙腈。

6种糖皮质激素分离的流动相梯度见表1。

表1 6种糖皮质激素分离的流动相梯度

1.6 质谱条件

电喷雾电离元（ESI）、负离子扫描、多反应监测（MRM） 模式、毛细管电压3.00 kV；锥孔电压30 V；脱溶剂气体温度350℃；脱溶剂气体流量700 L/Hr；锥孔气体流速150 L/Hr，在分析过程中以子母离子的保留时间和丰度比定性，以峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 化合物的优化

糖皮质激素在电喷雾质谱中的准分子离子峰有[M+H+]、[M-H-]、[M+HCOO-]等多种形式。试验采用50 ng/mL的标准品溶液，用流动注射泵连续进样进行质谱条件的优化。分别在正离子（ESI+）和负离子（ESI-）模式下进行全扫描，结果表明6种物质在[M+HCOO-]模式下均具有较高的响应，因此选用负离子扫描方式，分别对6种物质进行一级质谱扫描，确定待测化合物的准分子离子峰，并分别优化锥孔电压，通过氩气碰撞产生子离子进行二级质谱扫描，并优化碰撞能量，选择丰度较高的碎片离子作为定性与定量特征离子。

6种糖皮质激素质谱参数见表2。

表2 6种糖皮质激素质谱参数

2.2 色谱条件的优化

由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态下，因此流动相的组成会影响目标物的保留时间和峰型。当采用甲醇作为有机流动相时，倍他米松的响应值大大降低，且峰形拖尾，而选用酸溶液作为流动相时，在负离子模式下会抑制电离，因此选用甲酸铵和已经作为流动相。采用不同比例的流动相进行等度洗脱时，6种组分的灵敏度不理想，因此选用梯度洗脱。在梯度洗脱过程中，选择含有90%的水相到含有90%的有机相的快速切换，有助于化合物快速洗脱，减少色谱峰的拖尾现象。

6种糖皮质激素分离色谱见图1。

图1 6种糖皮质激素分离色谱

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线与线性关系

采用优化后的色谱条件和质谱条件测得的系列标准工作溶液，分别以每种物质的峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。在10～200 ng/mL的线性范围内，线性关系良好，相关系数均大于0.999。

6种糖皮质激素的标准曲线、相关系数及线性范围见表3。

表3 6种糖皮质激素的标准曲线、相关系数及线性范围

2.3.2 回收率、精密度及检出限

用空白基质加标样来计算6种糖皮质激素的回收率，共设置3个质量浓度梯度10，50，200 ng/mL，并计算测定结果的相对平均偏差反应结果的精密度。用10 ng/mL试样进样分析，计算6种物质的信噪比，分别按照S/N=3和S/N=10时6种糖皮质激素的浓度，确定检出限及定量限。结果见表4，可知该方法具有较高的灵敏度和较低的检出限。

6种糖皮质激素的回收率、检出限及定量限见表4。

表4 6种糖皮质激素的回收率、检出限及定量限

3 结论

建立了肉类中的6种糖皮质激素测定的超高效液相色谱-串联质谱的检测方法，对市售的数10种禽畜类肉进行了测定，高效液相色谱-串联质谱法具有简单快捷、检出限低等优点，而且能够快速实现多种物质的色谱分离，可快速检测肉类中的6种糖皮质激素，同时它将快速定性筛查和定量分析结合为一体，既能缩短检测时间，又能节约人力成本，提高工作效率。

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