饲料中花生四烯酸对中间球海胆存活、生长和肠道菌群组成的影响

李广，李世顺，李敏，吕德亮，丁君，常亚青，左然涛

(大连海洋大学水产与生命学院， 农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023)

海胆属于棘皮动物门(Echinodermata)，游走亚门(Eleutherozea)，海胆纲(Echinoidea)，现存800多种。海胆自然分布范围广，在中国、日本、法国、美国、加拿大和澳大利亚等地区均有养殖[1]。海胆养殖的饵料以海带、裙带菜和石莼等大型藻类为主，这些传统饵料存在着营养不均衡、供应不稳定和容易腐烂变质等诸多缺点[2]。因此，开发海胆人工配合饲料势在必行。已有研究结果表明，北方球海胆(Strongylocentrotusdroebachiensis)[3-5]、加州红海胆(Strongylocentrotusfranciscanus)[6]、绿海胆(Lytechinusvariegatus)和中间球海胆(Strongylocentrotusintermedius)[7-8]能够很好地吸收利用人工配合饲料，且能够显著促进海胆的生长和性腺发育速率。中间球海胆(S.intermedius)原产于日本北海道和俄罗斯远东沿海，由于其性腺色泽好，味甜，富含蛋白质、长链多不饱和脂肪酸和必需氨基酸，在国际市场上广受欢迎。1989年，大连海洋大学将其引入中国，对其进行驯化及培育，现已成为中国北方重要的海水养殖品种[9]。

海胆中长链多不饱和脂肪酸以花生四烯酸(ARA, 20:4n-6)和二十碳五烯酸(EPA, 20:5n-3)为主，且ARA作为长链多不饱和脂肪酸的重要成员，已被证实在海胆性腺发育过程中可以显著累积在卵细胞中[10]。近年来，肠道菌群组成对动物生长的影响越来越受到关注。研究表明，油酸在离体状态下可以刺激反刍动物瘤胃中纤维素降解相关菌群反刍动物月形单胞菌(Selenomonasruminantium)和牛肝菌(Butyrivibrioruminicola)的生长[11]；南美白对虾(Litopenaeusvannamei)中的肠道菌群会受到饲料脂肪源的影响[12]；膳食中添加鱼油较葵花油更易改变9月龄之前新生儿肠道菌群组成[13]。因此，脂肪酸饱和度与肠道菌群组成密切相关[14-15]。在斑马鱼(Daniorerio)中，肠道菌群能够调控营养物质的消化吸收和脂肪酸代谢，从而影响脂滴的形成[15]。不仅如此，肠道菌群在营养物质消化、脂肪代谢和免疫反应过程中也发挥着重要作用[10]。有关中间球海胆营养生理方面的研究已有较多报道[16-21]，但关于脂肪酸调控海胆肠道菌群变化的研究却罕见。因此，本研究探讨了饲料中ARA对中间球海胆存活、生长率和肠道菌群组成的影响规律，以期为明确ARA添加对中间球海胆存活、生长和肠道菌群组成的影响和开发适合中间球海胆的微生态制剂提供理论依据。

1 材料方法

1.1 实验饲料配制

实验饲料以海藻粉、豆粕和鱼粉为主要蛋白源，小麦粉为主要糖源，通过梯度添加ARA粉(甘油三酯型，100 mg/g，武汉嘉必优生物科技有限公司)和豆油配置等氮(24%)、等脂(4.5%)的4种饲料，使得饲料干物质中ARA水平依次为0.0、0.5%、1.0%和2.0%。具体配方和营养成分见表1和表2。

首先将所有饲料原料过80目筛网，所有干粉物质的饲料先混合均匀，然后把豆油均匀搓至混合饲料，最后加入水形成面团，水的添加量为饲料原料总质量的25%。利用自动制粒机制作成颗粒饲料，40 ℃下恒温烘干12 h，冷却，密封袋包装，储存于-20 ℃冰箱中备用。

表1 饲料配方和营养成分分析(%， 以干重计)Tab.1 Formulation and proximate composition of the experimental diets(%，eq.-dry diet) %

注：1表示海藻粉是以海带粉、海带藻粉与马尾藻科按质量比1∶1配制而成的混合物。以干物质计，其粗蛋白的含量为18.0%，粗脂质为0.9%，购自营口现代渔业科技产业园(中国辽宁省营口市)。2表示以干物质计，豆粕的粗蛋白含量为43.4%，粗脂质的含量为1.9%，购自营口现代渔业科技产业园(中国辽宁省营口市)。3表示以干物质计，鱼粉的粗蛋白含量为68.1%，粗脂质的含量为10.2%，购自青岛七好生物科技有限公司(中国山东省青岛市)。4表示以干物质计，小麦粉的粗蛋白含量为16.4%，粗脂质的含量为1.0%，购自营口现代渔业科技产业园(中国辽宁省营口市)。5表示复合矿物质(mg·kg-1或g·kg-1饮食)：CuSO4·5H2O，10 mg; Na2SeO3(1%)，25 mg；ZnSO4·H2O，50 mg；CoCl2·6H2O(1%)，50 mg；MnSO4·H2O，60 mg; FeSO4·H2O，80 mg； Ca(IO3)2，180 mg; MgSO4·7H2O，1 200 mg；沸石，18.35 g。6复合维生素(mg·kg-1或g·kg-1饮食)：维生素D，5 mg；维生素K，10 mg；维生素B12，10 mg；维生素B6，20 mg；叶酸，20 mg；维生素B1, 25 mg；维生素A，32 mg；维生素B2,45 mg；泛酸，60 mg；生物素，60 mg；烟酸，200 mg；α-生育酚，240 mg；肌醇，800 mg；抗坏血酸，2 000 mg；微晶纤维素，16.47 g。7ARA粉剂中ARA的纯度为100 mg·g-1，以甘油三酯的形式存在，购自嘉必优生物技术有限公司(中国湖北省武汉市)。

表2 饲料脂肪酸组成(g·kg-1, 以湿重计)Tab.2 Fatty acid content of formulated feeds (g·kg-1, eq.-wet weight) in this study

注：某些含量较少、微量或未检出的脂肪酸，如C22:0、C20:0、C24:0、C14:1、C20:1n-9、C22:1n-11、C20:2n-6、C20:3n-6和C22:5n-3未在表中列出。1SFA(saturated fatty acids)为饱和脂肪酸。2MUFA(monounsaturated fatty acid)为单不饱和脂肪酸。3PUFA(polyunsaturated fatty acid)为多不饱和脂肪酸。

1.2 摄食生长实验

摄食生长实验在农业部北方海水增养殖重点实验室进行。实验海胆来自于大连旅顺养殖场，均属于同一日龄，初始重量约为60 g。在摄食生长实验之前，将所有中间球海胆(S.intermedius)成胆暂养在1 m3的水槽中，每2天换水一次，换水量为水槽总体积的1/2，并且吸除槽底残饵和粪便，然后投喂海胆体重5%～10%的配合饲料，使其适应饵料和养殖环境。2周之后，测定海胆初始体重(W0)后随机分配至12个网笼(20 cm×30 cm×50 cm)中，每个网笼20只海胆。每种饲料投喂3个平行网笼的海胆，摄食生长实验持续56 d。每天记录海胆的存活状况，以海胆的附着力消失或者掉刺现象作为海胆死亡的标准。实验期间，水温为(14±5)℃，盐度为30，水中溶氧大于7.0 mg/L。

1.3 取样

在56 d投喂实验结束后，记录海胆存活情况及海胆的终末体重(Wt), 每个网笼随机取10只海胆，无菌解剖取其肠道内容物并收集于灭菌离心管中，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中待测。

1.4 肠道菌群多样性分析

1.4.1 DNA提取和PCR扩增

利用E.Z.N.A.®DNA试剂盒(美国Omega Bio-tek)对肠道总菌群DNA进行提取，并利用NanoDrop (美国Thermo Fisher Scientific)对DNA进行定量。

PCR扩增细菌16S rDNA的V3～V4 区，引物序列为：515F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。扩增条件如下：95 ℃ 3 min预变性； 95 ℃ 变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s， 进行27个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.4.2 PCR产物的混样和纯化

根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用Gene JET(美国Thermo Scientific)胶回收试剂盒回收产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (美国Axygen Biosciences)对PCR产物进行纯化。

1.4.3 文库构建和上机测序

使用NEB Next®4 UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina(美国New England Biolabs)建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，再使用Illumina MiSeq上机测序。

采用Mothur中的Pre. Cluster软件对测序进行校正；采用UCHIME(美国)软件，以SILVA数据库中序列作为模板去除嵌合体；采用UCLUST软件对序列进行聚类，并对操作分类单元进行覆盖率和稀缺型曲线分析，以及丰富度指数(Chao)和多样性指数(Simpson)分析。

1.5 数据计算与分析

成活率(grow rate,GR, %)=实验结束时海胆存活数量/实验开始海胆存活数量×100

式(1)

增重率(weight gain rate,WGR, %)=(终末体重Wt- 初始体重W0)/初始体重W0×100

式(2)

实验数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析，在单因素方差分析达到显著水平时(P<0.05)，采用Turkey’s检验进行多重比较，数据表示为平均值±标准误。

2 结果

2.1 饲料中ARA添加量对海胆存活率和生长影响

由表3可见，饲料中ARA添加量未对海胆成活率产生显著影响(P>0.05)。随着饲料中ARA添加量的增加，海胆终末体重和增重率均呈现先升高后下降的趋势。当饲料中ARA添加量为1.0%时，海胆终末体重最高，虽然与2.0% ARA添加组差异不显著(P>0.05)，但显著高于未添加ARA组和0.5% ARA处理组(P<0.05)。饲料中ARA添加量对海胆增重率的影响也呈先升后降趋势，即ARA添加浓度为1.0%时，海胆增重率最高(12.70%)，而未添加组最低(3.11%)(表3)。

表3 饲料中ARA含量(%，以干重计)对中间球海胆成活率和增重率的影响Tab.3 Effects of dietary ARA(%，eq.-dry weight) on growth performance of adult sea urchin (Strongylocentrotus intermedius)

注：同一列内不同上标字母表示平均值有显著性差异(P<0.05)，标相同字母或者没有标注字母的表示平均值显著性差异不显著(P>0.05)。

2.2 饲料中ARA含量对海胆肠道菌群多样性的影响

本次测序深度为5×104条tags，测序有效覆盖率约为99%。Shannon指数反应菌群组成多样性，该指数越大多样性越高。本研究中海胆肠道菌群Shannon指数平均值为2.68～3.06，当饲料中ARA含量为1.0%时，海胆肠道菌群多样性最高，但是不同饲料组海胆间差异不显著(表4)，且与Simpson多样性指数分析的结果相一致。

2.3 饲料中ARA对海胆肠道菌群组成的影响

本研究中，海胆肠道菌群丰度较高的6个门分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋杆菌门(Spirochaetae)、软壁菌门(Tenericutes)和梭杆菌门(Fusobacteria)(图5)。其中变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)菌群的丰度随着饲料中ARA含量增加出现了升高的趋势；厚壁菌门(Firmicutes)和软壁菌门(Tenericutes)的丰度随着饲料中ARA含量增加出现了下降的趋势；螺旋杆菌门(Spirochaetae)和梭杆菌门(Fusobacteria)的丰度随着饲料中ARA含量增加出现了无规律的变化，但饲料中ARA对所有菌群丰度均未产生显著影响(P>0.05)(表5)。本研究中海胆肠道菌群Chao1指数分布在174.1～196.7，当饲料中ARA含量为0.5%时，海胆肠道菌群多样性最高，但是不同饲料组海胆间差异不显著(P>0.05，表4)。因此，推断总菌群的丰度不受饲料中ARA含量的影响。

表4 饲料中ARA含量(%，以干重计)对海胆肠道菌群丰富度和细菌多样性的影响Tab.4 Illumina high-throughput data, bacterial diversity richness estimator (Chao 1) and diversity estimators (Shannon and Simpson)for intestinal bacterial diversity of adult sea urchin (Strongylocentrotus intermedius) fed dietswith graded content of ARA (%，eq.-dry diet)

注：同一行内不同上标字母表示平均值有显著性差异(P<0.05)，标相同字母或无标注字母的表示平均值差异不显著(P<0.05)，下同。

表5 饲料中ARA含量(%，以干重计)对海胆肠道菌群基于门水平的相对丰度的影响Tab.5 Frequency distribution of bacterial phyla in the intestine of sea urchin fed diets with graded levelof ARA(%， eq.-dry diet) %

在属水平上，弧菌属(Vibrio)、(Lutibacter)和芽孢杆菌属(Bacillus)受饲料中ARA含量的影响显著。其中，弧菌属(Vibrio)丰度随着饲料中ARA含量的升高而显著升高，且在2.0% ARA处理组具有最大相对丰度(36.34%)，其次是1.0% ARA处理组(12.44%)；1.0%和2.0%ARA处理组海胆肠道中弧菌属(Vibrio)的丰度显著高于对照组(7.55%)(P<0.05)。随着饲料中ARA含量的升高，海胆肠道中(Lutibacter)的相对丰度具有与弧菌属(Vibrio)相似的变化趋势，当饲料中ARA含量为2.0%时，该属的相对丰度最高(31.13%)，显著高于其他3个处理组(6.90%～11.63%)(P<0.05)。当饲料中ARA含量由0.0升高至0.5%时，海胆肠道中芽孢杆菌属(Bacillus)的相对丰度由26.00%升高至33.25%(P>0.05)，之后随着饲料ARA含量的进一步升高显著降低至2.08%(P<0.05，表6)。

表6 饲料中ARA含量(%，以干重计)对海胆肠道各属细菌丰度的影响Tab.6 The relative abundance of main genus in the intestine of sea urchin in response to graded level of ARA(%，eq.-dry diet) %

注：“—”表示该属的丰度较低，未达到检测的限度。

3 讨论

饲料中添加不同浓度的ARA虽然对海胆的成活率、肠道菌群的多样性和门水平的相对丰度没有显著影响，但对海胆的增重率和海胆肠道菌群的组成有影响。此结果将为开发适合海胆的微生态制剂提供参考依据。

当饲料中ARA含量较高时(1.0%～2.0%)，海胆生长速率显著高于ARA低添加量组和空白处理组(P<0.05)。性腺作为海胆唯一可食性部分，提高性腺质量分数具有重要的实际意义。前期研究结果表明，当饲料中ARA含量为1.0%～2.0%时，海胆性腺指数最高(待发表)。以上实验结果说明饲料中适宜的ARA含量对海胆的生长和生理功能具有重要的作用，这和某些海水鱼相似[22-23]。但饲料中ARA的含量对海胆的成活率没有产生显著影响(P>0.05)，大规格(207.16±0.72) g鲈(Lateolabraxjaponicas)成活率也不受ARA添加影响[24]，推测其原因可能是成体海洋生物体有较强的抗应激能力，对ARA的依赖性小，所以ARA的含量对成体的成活率没有产生显著影响(P>0.05)，这和某些海水鱼的研究结果也类似[22-24]。因此，在海胆饲料中添加适宜含量的ARA能够显著提高海胆的经济价值。饲料中ARA含量影响水产动物的饲料转化率。如在鱼类的研究结果表明，当饲料中缺乏ARA时，饲料转化率在草鱼和鲈中显著降低，即饲料利用率较差[25]。类似地，当饲料中其他必需脂肪酸如n-3 LC-PUFA(0.1%，以饲料干物质计)含量较低时，饲料转化率和蛋白质沉积率也较差[26]。但本研究并未研究海胆对饲料的转化率，这有待进一步探讨。

本研究中，中间球海胆肠道中检测到的菌群主要门类分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和软壁菌门(Tenericutes)等。已有研究表明：变形菌门(Proteobacteria)在斑节对虾(PenaeusMonodon)[27]、南美白对虾[11]、斑马鱼[28]、草鱼(Ctenopharyngodonidella)[29]和黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[30]的肠道中均具有较高的丰度。拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)是人类和小鼠肠道中最为丰富的细菌门类[31]。由于拟杆菌门(Bacteroidetes)主要在纤维素分解过程中发挥重要作用，而大部分水产动物对糖类利用能力较差，其饲料中纤维素等碳水化合物含量相对较低，这可能是导致鱼类和对虾肠道菌群中拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度明显低于哺乳动物的重要原因[28,32]。在海参中的研究结果也证实这一点，司滨等[33]研究表明海参肠道中拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度低于变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。随着饲料中ARA含量的升高，厚壁菌门(Firmicutes)的丰度显著性降低。相关研究表明，厚壁菌门(Firmicutes)的主要作用是促进肠道吸收食物中的能量，其产生的化合物与脂肪的沉积有关，是一类和肥胖相关的细菌[33]。厚壁菌门(Firmicutes)丰度的降低会减少脂肪酸在肠道内沉积的概率，从而保证更多的脂肪酸能够运输到性腺中，保证性腺的正常发育，从而提高海胆的经济值。

在本研究中，海胆肠道中的弧菌属(Vibrio)、(Lutibacter)和芽孢杆菌属(Bacillus)丰度较高；随着饲料中ARA含量的升高，弧菌属(Vibrio)的相对丰度显著升高。尽管很多病原菌(如哈维氏弧菌)也属于弧菌属(Vibrio)，但是该属中仍然有一些具有抑菌和促生长的种类，如溶藻弧菌等[34-35]。本研究中，当饲料中ARA含量为2.0%时，海胆肠道中(Lutibacter)的丰度显著提高，其中该属中(Lutibacterflavussp.)又参与类胡萝卜素合成[36]。类胡萝卜素具有较强的抗氧化功能，可以保护主要卵黄蛋白(major yolk protein，MYP)过氧化，进而增加其在性腺中的累积量[37]。芽孢杆菌属(Bacillus)的丰度随着饲料中ARA含量的升高而升高，芽孢杆菌属(Bacillus)中有些种类(如Bacillussubtilis和Bacillusamyloliquefaciens)在草鱼中被证实具有抗氧化的功能[38]。因此，ARA的添加有可能对海胆性腺卵黄蛋白累积和抗氧化能力提升有益，此问题也将在未来的研究中予以明确。

4 结论

添加3种不同水平的ARA对中间球海胆的成活率、肠道菌群的多样性和门水平的相对丰度没有显著影响，但对海胆的增重率和海胆肠道菌群的组成有影响。当饲料中ARA的含量为1.0%时，海胆肠道内有菌群结构较为合理，并且海胆增重率最大，因此，1.0%为本实验条件下ARA饲料中添加的推荐浓度。在饲料中ARA显著影响了海胆的肠道菌群组成，且较高水平的ARA可以提高变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidete)以及弧菌属(Vibrio)和(Lutibacter)的丰度，降低厚壁菌门(Firmicutes)和软壁菌门(Tenericutes)以及芽孢杆菌属(Bacillus)和(CandidatusHepatoplasma)属的丰度；变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidete)以及弧菌属(Vibrio)和(Lutibacter)的提高可能与促生长有关。未来研究需要在种的水平上确定对ARA敏感的细菌种类。本研究将为海胆饲料中益生菌的添加提供理论依据。

参考文献：

[1] 左然涛, 侯受权, 常亚青, 等.海胆营养生理研究进展[J]. 大连海洋大学学报, 2016, 31(4): 463-468.

[2] 左然涛, 侯受权, 李广, 等. 中间球海胆消化酶和抗氧化酶活力的研究[J]. 饲料工业, 2016, 37(22): 26-29.

[3] Liyana-Pathirana C, Shahidi F, Whittick A. The effect of an artificial diet on the biochemical composition of the gonads of the sea urchin (Strongylocentrotusdroebachiensis) [J]. Food Chem, 2002, 79(4): 461-472.

[4] Pearce C M, Daggett T L, Robinson S M C. Effect of urchin size and diet on gonad yield and quality in the green sea urchin (Strongylocentrotusdroebachiensis) [J]. J World Aquacult Soc, 2004, 233(1): 337-367.

[5] Daggett T L, Pearce C M, Tingley M, et al. Effect of prepared and macroalgal diets and seed stock source on somatic growth of juvenile green sea urchins (Strongylocentrotusdroebachiensis) [J]. J World Aquacult Soc, 2005, 244(1/2/3/4): 263-281.

[6] Mcbride S C, Price R J, Tomb P D, et al. Comparison of gonad quality factors: color, hardness and resilience, ofStrongylocentrotusfranciscanusbetween sea urchins fed prepared feed or algal diets and sea urchins harvested from the Northern California fishery [J]. J World Aquacult Soc, 2004, 233(1/2/3/4): 405-422.

[7] Lawrence J M, Chang Y Q, Cao X B, et al. Potential for Production of Uni byStrongylocentrotusintermediususing dry formulated feeds [J]. J World Aquacult Soc, 2011, 42(2): 253-260.

[8] Chang Y Q, Lawrence J M, Cao X B, et al. Food consumption, absorption, assimilation and growth of the sea urchinStrongylocentrotusintermediusfed a prepared feed and the algaLaminariajaponica[J]. J World Aquacult Soc, 2005, 36(1): 68-75.

[9] 常亚青, 王子臣. 温度和藻类饵料对虾夷马粪海胆摄食及生长的影响[J]. 水产学报, 1999(1):69-76.

[10] Carboni S, Hughes A D, Atack T, et al. Fatty acid profiles during gametogenesis in sea urchin (Paracentrotuslividus): effects of dietary inputs on gonad, egg and embryo profiles[J]. Comp Biochem Physiol, Part A: Mol.Integr Physiol, 2013, 164(2): 376-382.

[11] Maczulak A E, Dehority B A, Palmquist D L. effects of long-chain fatty acids on growth of rumen bacteria[J]. Appl Environ Microbiol, 1981, 42(5): 856-862.

[12] Zhang M, Sun Y, Chen K, et al. Characterization of the intestinal microbiota in Pacific white shrimp,Litopenaeusvannamei, fed diets with different lipid sources[J]. J World Aquacult Soc, 2014, 434: 449-455.

[13] Andersen A D, Mølbak L, Michaelsen K F, et al. Molecular fingerprints of the human fecal microbiota from 9 to 18 months old and the effect of fish oil supplementation.[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2011, 53(3): 303-309.

[14] Liu T, Hougen H, Vollmer A C, et al. Gut bacteria profiles of Mus musculus at the phylum and family levels are influenced by saturation of dietary fatty acids.[J]. Anaerobe, 2012, 18(3): 331-337.

[15] Yu H N, Zhu J, Pan W S, et al. Effects of fish oil with a high content of n-3 polyunsaturated fatty acids on mouse gut microbiota[J]. Arch Med Res, 2014, 45(3): 195-202.

[16] Semova I, Carten J, Stombaugh J, et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish[J]. Cell Host Microbe, 2012, 12(3): 277-288.

[17] Zhao C, Liu P J, Zhou H S, et al. Diel observation on the distribution of the sea urchinStrongylocentrotusintermediusunder different food availability and shelter conditions in the laboratory[J]. Mar Freshwater Behav Physiol, 45(6): 357-364.

[18] 侯受权, 左然涛, 常亚青, 等. 饲料脂肪水平对中间球海胆幼胆生长、消化酶和热胁迫后抗氧化酶活力的影响[J]. 大连海洋大学学报, 2016, 31(5): 538-543.

[19] 左然涛, 李敏, 李广, 等. 饲料中添加N-氨甲酰谷氨酸对中间球海胆成胆生长、性腺发育、消化酶活力和免疫性能的影响[J]. 饲料工业, 2017, 38(10): 1-4.

[20] 吕德亮, 李敏, 吴反修, 等. 雌二醇对中间球海胆生长、性腺发育及胆固醇代谢的影响[J].大连海洋大学学报, 2017, 32(5): 501-508.

[21] Hannesson R. Aquaculture and fisheries[J]. Mar Policy, 2003, 27(2): 169-178.

[22] Villalta M, Estevez A, Bransden M P. Arachidonic acid enriched live prey induces albinism in Senegal sole (Soleasenegalensis) larvae[J]. J World Aquacult Soc, 2004, 245(1):193-209.

[23] Lund I, Steenfeldt S J, Hansen B W. Effect of dietary arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid on survival, growth and pigmentation in larvae of common sole (SoleasoleaL.)[J]. J World Aquacult Soc, 2007, 273(4):532-544.

[24] 王成强, 梁萌青, 徐后国，等. 大规格鲈鱼(Lateolabraxjaponicas)对饲料中花生四烯酸的需求量[J]. 渔业科学进展, 2016, 37(5): 46-55.

[25] Xu H G, Ai Q H, Mai K S, et al. Effects of dietary arachdonic acid on growth performance, survival, immune response and tissue fatty acid composition of juvenile Japanese seabass,Lateolabraxjaponicus[J]. J World Aquacult Soc, 2010, 307(1): 75-82.

[26] Mozanzadeh M T, Marammazi J G, Yavari V, et al. Dietary n-3 LC-PUFA requirements in silvery-black porgy juveniles (Sparidentexhasta)[J]. J World Aquacult Soc, 2015, 448: 151-161.

[27] Rungrassamee W, Klanchui A, Maibunkaew S, et al. Characterization of intestinal bacteria in wild and domesticated adult black tiger shrimp (Penaeusmonodon)[J]. PLoS ONE, 2014, 9(3): e91853.

[28] Roeselers G, Mittge E K, Stephens W Z, et al. Evidence for a core gut microbiota in the zebrafish[J]. ISME J, 2011, 5(10): 1595-1608.

[29] Wu S, Wang G, Angert E R, et al. Composition, diversity, and origin of the bacterial community in grass carp intestine[J]. PloS ONE, 2012, 7(2): e30440.

[30] Wu S, Gao T, Zheng Y, et al. Microbial diversity of intestinal contents and mucus in yellow catfish (Pelteobagrusfulvidraco)[J]. J World Aquacult Soc, 2010, 303(1/2/3/4): 1-7.

[31] Zhang M, Chekan J R, Dodd D, et al. Xylan utilization in human gut commensal bacteria is orchestrated by unique modular organization of polysaccharide-degrading enzymes[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2014, 111(35): E3708-E3717.

[32] Daniel H, Gholami A M, Berry D, et al. High-fat diet alters gut microbiota physiology in mice[J]. ISME J, 2014, 8(2): 295-308.

[33] 司滨, 王轶南, 刘海映, 等. 饲料中添加壳寡糖对刺参肠壁菌群的影响[J]. 大连海洋大学学报, 2017, 32(2): 167-171.

[34] Gatesoupe F-J. Siderophore production and probiotic effect of, Vibrio sp. associated with turbot larvae,Scophthalmusmaximus[J]. Aquat Living Resour, 1997, 10(4): 239-246.

[35] Jorquera M A, Riquelme C E, Loyola L A, et al. Production of bactericidal substances by a marine vibrio isolated from cultures of the scallopArgopectenpurpuratus[J]. Aquacult Int, 2000, 7(6): 433-448.

[36] Cook E J, Hughes A D, Orr H, et al. Influence of dietary protein on essential fatty acids in the gonadal tissue of the sea urchinsPsammechinusmiliaris, andParacentrotuslividus, (Echinodermata)[J]. J World Aquacult Soc, 2007, 273(4): 586-594.

[37] Shpigel M, Schlosser S C, Benamotz A, et al. Effects of dietary carotenoid on the gut and the gonad of the sea urchinParacentrotuslividus[J]. J World Aquacult Soc, 2006, 261(4): 1269-1280.

[38] Wei-Fen L I, Deng B, Chen N N, et al. Effects of bacillus on water quality,growth and antioxidant activity of intestinal mucosa of ctenopharyngodon idellus[J]. J Hydroecol, 2012, 33(1): 65-70.