饲料脂肪水平对血鹦鹉幼鱼肝脏免疫及抗氧化酶的影响

薛晓强，赵月，王帅，赵琳，胥亚夫，王友权，王睿瑞，任同军，韩雨哲*

(1.大连海洋大学水产与生命学院，农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室， 辽宁 大连 116023；2.辽渔南极磷虾科技发展有限公司， 辽宁 大连 116113)

血鹦鹉属鲈形目(Perciformes)慈鲷科(Cichlidae)，是雌性紫红火口(Cichlasomasynspilum♀)和雄性红魔鬼(Cichlasomacitrinellum♂)杂交产生的后代，俗称“发财鱼”“财神鱼”，体色红艳，体型短圆，嘴呈心形且无法合拢[1]。因其体色艳丽，外观漂亮，在中国大陆及台湾地区都广受喜爱。国内对血鹦鹉研究较少，主要研究其体色和免疫能力[2]。幼鱼在鱼类的生活史中处于快速生长期[3]，是营养学相关实验的良好实验对象，具有代谢快、生长迅速等优势[4]。

脂肪是鱼类重要的营养素，不仅能为机体提供能量还能补充必须脂肪酸[5]，促进其生长发育[6]。鉴于脂肪的重要性，制作鱼类饲料时通常均需添加脂肪。然而脂肪的添加并不是越多越好，过量的添加，易使鱼体内脂肪累积，导致脂肪肝[7]，并引起鱼体免疫力下降[8]。免疫酶和抗氧化酶是衡量机体健康与否的重要指标[9]。适宜的饲料脂肪水平会提升大西洋鲑(Salmosalar)的免疫酶活力[10]；也会升高花鲈(Lateolabraxmaculatus)抗氧化酶活力，但过高的脂肪水平则会使其下降[11]。尽管免疫酶和抗氧化酶在其他鱼种有单独的研究，但在血鹦鹉幼鱼中对两种酶同时评估的研究却缺乏。因此，本研究将免疫酶和抗氧化酶构建联系,通过同时测定不同饲料脂肪水平饲养后的血鹦鹉幼鱼肝脏免疫相关酶活力：碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LMZ)以及抗氧化相关酶活力：超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化酶(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)含量，研究其影响，旨在确定血鹦鹉幼鱼饲料的最适脂肪添加水平。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼及管理

从辽阳观赏鱼养殖基地购买200尾初始体重为(1.20±0.30) g的血鹦鹉，在水温25～27 ℃，水中溶氧>7 mg/L的实验室环境下适应性驯养7 d，而后挑选健康的幼鱼，进行饲喂实验。将实验用鱼按投喂饲料的脂肪水平不同分为5组，每组30尾。本实验使用60 cm×70 cm×120 cm的40 L超白玻璃缸，以曝气24 h以上的自来水作为实验水体，采用直径1.4 cm气石进行24 h充气，用加热棒维持水温在25 ℃以上。每日8:00、12:30和16:00进行3次表观饱食投喂，每日进行3次吸底1次换水，换水量约为1/3，实验共饲养42 d。

1.2 幼鱼饲料的配制及保存

实验饲料以鱼粉、豆粕、小麦粉和明胶为主要蛋白源，以豆油为主要脂肪源(配方见表1)，配制不同脂肪水平饲料CL1(粗脂肪4.77%)、CL2(粗脂肪8.75%)、CL3(粗脂肪11.68%)、CL4(粗脂肪16.25%)、CL5(粗脂肪23.70%)。饲料原料经混合后，放入2 mm粒径的制粒机中挤压成颗粒，然后放入50 ℃烘箱中，至水分含量到10%，存入做好标记的自封袋中，放于-20 ℃冰箱中保存。

表1 血鹦鹉饲料配方Tab.1 Feed formula for blood parrot juveniles

注：1除明确给出的单位，其他单位均为g·kg-1，2混合维生素和混合矿物质参照Wang等[12]。

1.3 样品收集

采样前，将饲养的血鹦鹉幼鱼禁食24 h。将血鹦鹉放入冰水中，待其完全麻醉取出。每个实验水槽随机取5～6尾实验鱼在冰上进行无菌解剖，取肝脏，同组混样装入试管。将取出的样品暂时放入液氮中快速冷冻，待全部取完，放入-80 ℃冰箱保存。

1.4 肝脏免疫及抗氧化相关酶活力测定

将之前解剖保存在-80 ℃的冰箱中的肝脏取出，按质量体积比1∶9(g∶mL)加入4 ℃生理盐水，使用玻璃匀浆器进行制浆，在冰水浴条件下制成10%的匀浆液，4 ℃ 2 500 r/min离心(CT15RE 型日立冷冻离心机)10 min，取上清液。实验采用试剂盒是购自南京建成生物工程有限公司，根据试剂盒说明书对碱性磷酸酶(A059-1)、酸性磷酸酶(A060-1)、溶菌酶(A050-1)、超氧化物歧化酶(A001-3)、总抗氧化酶(A015-1)、过氧化氢酶(A007-1-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(A005)和丙二醛(A003-1)进行测定。

1.5 二次曲线回归方程构建

使用Excel 2007对饲料脂肪水平(%)和酶活力或浓度(U/g或nmol/mg)构建二次曲线回归方程，得到最适饲料脂肪水平。

1.6 数据分析

实验测得数据使用SPSS 20.0(IBM, USA)进行统计分析，使用Turkey’s方法进行多重比较，且P<0.05，认为差异性显著。结果采用平均值±标准差(Mean±SD)方式表示。

2 结果与分析

2.1 饲料脂肪水平对血鹦鹉幼鱼肝脏免疫酶活力的影响

由表2可知，血鹦鹉肝脏酸性磷酸酶(ACP)活力随饲料脂肪水平升高出现先升高后下降的趋势，在CL4组粗脂肪含量16.25%的时候达到最大值，与CL3组无显著性差异(P>0.05)，但显著高于CL1、CL2和CL5组(P<0.05)；碱性磷酸酶(AKP)活力与ACP趋势相同，即先上升后下降，在CL4组粗脂肪含量16.25%时达到最高并显著高于其他各组(P<0.05)；溶菌酶(LZM)活力也呈先上升后下降的趋势，在CL3组粗脂肪含量11.68%时达到最大，与其他组差异显著(P<0.05)。

2.2 饲料脂肪水平对血鹦鹉幼鱼肝脏抗氧化酶的影响

由表3可知，超氧化物歧化酶(SOD)活力随饲料脂肪水平升高呈先升高后降低的趋势，在CL3组粗脂肪含量11.68%时活力最高，与CL4组无显著性差异(P>0.05)，但与CL1、CL2和CL5组差异显著(P<0.05)；总抗氧化酶(T-AOC)活力表现为先上升后下降，在CL3组脂肪含量11.68%时最大且显著高于其他各组(P<0.05)；过氧化氢酶(CAT)活力趋势为先升高后下降，在CL4组粗脂肪含量16.25%时最高，显著高于其他组(P<0.05)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力呈先上升后下降趋势，在CL3组粗脂肪含量11.68%时达到最大且显著高于其他各组(P<0.05)；丙二醛(MDA)呈先上升后下降的趋势，在CL4组粗脂肪含量16.25%时达到最大，与CL3组差异不显著(P>0.05)，但与其余3组有显著性差异(P<0.05)。

2.3 二次曲线回归方程分析

通过多重比较分析得知，免疫酶中AKP随着饲料脂肪水平的变化最为明显；抗氧化酶中GSH-Px和CAT则易受饲料脂肪水平影响，其中前者又比后者更敏感。因此，本研究以AKP、GSH-Px和MDA为重要关注指标构建二次曲线回归方程，从而确定血鹦鹉幼鱼饲料中最适宜的脂肪水平。AKP二次曲线回归方程为y1=-4.820 1x12+161.44x1-602.61，R2=0.729 0；GSH-Px二次曲线方程为y2=-14.687x22+460.88x2-166 3，R2=0.615 5；MDA二次曲线回归方程为y3=-0.033 3x32+1.052 4x3-4.119 6，R2=0.685。当x1=15.54时，y1达到最大值；当x2=15.69时，y2达到最大值；当x3=15.80时，y3达到最大值。因此，血鹦鹉幼鱼饲料脂肪建议浓度为15.80%～16.75%时有利于提高免疫酶和抗氧化物酶含量。

表2 饲料脂肪水平对血鹦鹉肝脏免疫酶活力的影响Tab.2 Effects of dietary lipid levels on the immune enzyme activity of blood parrot juveniles

注：同一列用不同字母表示差异性显著P<0.05，下同。ACP(acid phosphatase)为酸性磷酸酶, AKP(alkaline phosphatase)为碱性磷酸酶,LMZ(lysozyme)为溶菌酶。

表3 脂肪饲料水平对血鹦鹉抗氧化酶活性的影响Tab.3 Effect of dietary lipid levels on the antioxidative enzymes of blood parrot juveniles

注:CAT(catalase)为过氧化氢酶, GSH-Px(glutathione peroxidase)为谷胱甘肽过氧化氢酶, MDA(malondialdehyde)为丙二醛。

3 讨论

3.1 饲料脂肪水平对血鹦鹉幼鱼免疫酶的影响

ACP是吞噬溶酶体的重要组成部分，ACP在细胞吞噬和包囊反应中被释放，参与对带磷酸酯基团异物的降解过程[13]。AKP能够促进营养物质的转运和吸收，从而加强机体的非特异性免疫能力[14]。本研究中ACP和AKP是保持体内环境稳态所必需的酶，当免疫水平升高或降低时，它们会产生相应的变化[15-16]。本研究中ACP和AKP活力先上升后下降，与付旭等[17]对淡黑镊丽鱼(Labidochromiscaeruleus)的研究结果相符，且低脂肪水平组CL1和CL2组显著低于较高脂肪水平CL3和CL4组(P<0.05)，但高脂肪水平的CL5组也显著低于CL3和CL4组(P<0.05)。肝脏的免疫能力是与饲料中适宜的脂肪含量并非呈现简单的正相关性，而是Λ型，即脂肪在适宜浓度时可提高其免疫力，高于此浓度则降低。LMZ是鱼体内重要的非特异免疫酶，在机体免疫过程中能催化水解细菌细胞壁而导致细菌溶解死亡[18-19]，LMZ活力也可间接的反映机体免疫状态。本研究中LMZ活力先上升后下降，与陈乃松等[20]对大口黑鲈(Micropterussalmoides)的研究结果一致，低脂肪水平组CL1和CL2组显著低于较高脂肪水平CL3和CL4组(P<0.05)，但高脂肪水平的CL5组显著低于前面4组(P<0.05)，这说明添加适量脂肪水平，可促进血鹦鹉幼鱼肝脏免疫能力，但过高则不益。3种免疫酶活力在过高的饲料脂肪水平都出现了下降的趋势，其原因可能是由于脂肪过量引起代谢应激并提高了肝脏代谢率，降低机体免疫力[21]。

3.2 饲料脂肪水平对血鹦鹉幼鱼肝脏抗氧化相关酶的影响

SOD作为抗氧化酶，能够清除有危害性的活性氧，通过催化歧化作用将过氧化物自由基转变成过氧化氢和氧[22-23]。CAT能够将体内的过氧化氢分解成水和氧气，提高机体抗氧化能力。本研究中SOD和CAT活力均呈现先升高后下降的趋势，这与施兆鸿等[24]对褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratu)的研究趋势一致。本研究中，当饲料脂肪水平为11.68%和16.25%时，SOD活力未出现显著性差异(P>0.05)，而CAT活力则出现了显著性差异(P<0.05)；但Mourente等[25]对金头鲷(SparusaurataLinnaeus)的研究以及崔培等[26]对红白锦鲤(Cyprinuscarpiohaematopterus)的实验结果均为SOD和CAT出现显著差异(P<0.05)，此与本实验结果不一致，这可能是由于酶对外界刺激所产生的变化具有周期性，不同条件下机体对刺激产生适应所需时间也不同[27]。T-AOC活力与SOD和CAT活力趋势相同也是随着饲料脂肪水平的升高，先上升后下降，与张晨捷等[28]对云纹石斑鱼(Epinehelusmoara)的研究结果相符，较高脂肪组CL3显著高于低脂肪组CL1和CL2组，并显著高于较高脂肪组CL4，高脂肪组CL5(P<0.05)，这可能是饲料中过量的脂肪，减弱了机体消除自由基的能力，增加了体内过氧化物含量而抑制了机体抗氧化能力[29]。GSH-Px是机体中重要的过氧化物分解酶，它能把有害的过氧化物还原成无害的羟基化合物，起到保护细胞膜的结构和功能的作用[30]。在本研究中，GSH-Px活力随饲料脂肪水平升高，出现了先升高后降低的现象，与孙阳等[31]对红鳍东方鲀的研究结果一致，其中较高脂肪组CL4显著高于较低脂肪组CL1和CL2、较高脂肪水平组CL3和高脂肪水平组CL5(P<0.05)，说明适量提高饲料脂肪水平可提高血鹦鹉抗氧化能力，但过高的脂肪会使血鹦鹉抗氧化能力降低。MDA作为脂质过氧化反应的主要代谢产物，是反映氧化应激的重要指标，其含量的升高是脂质过氧化物增多的表现[32]，可直接用来判断肝脏受损程度。本研究中MDA随饲料脂肪水平的上升，呈先升高后降低趋势，但张春暖等[33]对梭鱼的研究和施兆鸿等[24]对褐菖鲉的研究结果均为MDA随饲料脂肪水平升高而升高，这与本实验结果不一致，其原因可能是其他抗氧化酶活力的下降，作为代谢产物的MDA减少。本研究中，随饲料脂肪水平的升高，血鹦鹉幼鱼肝脏免疫及抗氧化酶的活力均出现先升高后降低的趋势，两者受饲料脂肪水平的影响趋势相似，反映了血鹦鹉幼鱼肝脏免疫酶和抗氧化酶的密切关系。

血鹦鹉为人工杂交的品种，其母本紫火山口为杂食性鱼类，父本红魔鬼为肉食性鱼类，但血鹦鹉作为人工培育品种，其食性尚未有明确定义。王吉桥等[34]对七彩神仙鱼(Symphysodonaequifasciata)的研究表明，七彩神仙鱼幼鱼饲料中适宜脂肪含量在12.02%～17.17%之间；在李雪菲等[35]的实验中，美国红鱼(Sciaenopsocellatus)饲料的最适脂肪水平为7.19%～9.17%；虾类和其他甲壳类动物在饲料脂肪水平5%～6%时增重效果最为明显[36]。本研究通过二次曲线回归方程寻找到血鹦鹉幼鱼饲料脂肪水平为15.80%～16.75%，高于多数杂食性鱼类对饲料脂肪的需求量，与肉食性淡水热带鱼七彩神仙鱼相似，本研究的结果能够为血鹦鹉幼鱼饲料的营养精准配制提供理论基础。

4 结论

本研究对体重为(1.20±0.30)g的血鹦鹉幼鱼饲喂5组不同脂肪水平饲料42 d，通过测其肝脏免疫相关酶及抗氧化酶活力，发现血鹦鹉幼鱼肝脏免疫及抗氧化酶活力随饲料脂肪水平升高呈先上升后下降的趋势，通过建立二次曲线回归方程得出：血鹦鹉幼鱼最适饲料脂肪为15.80%～16.75%。本研究能够为血鹦鹉幼鱼实用饲料营养的精准供给提供理论基础。

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