5-氟尿嘧啶诱导小鼠化疗性肠黏膜炎模型的建立

谭婉贤，熊晏，赖莉敏，颜霞，陈超，瞿礼萍*，邹文俊*

(1. 成都中医药大学药学院，成都　611137； 2. 地奥集团成都药业股份有限公司，成都　610000)

化疗性肠黏膜炎(chemotherapy-induced intestinal mucositis，CIM)是肿瘤患者化疗时常见的剂量限制性不良反应。欧洲肿瘤医学协会(European Society for Medical Oncology，ESMO)将其定义为由肿瘤治疗引起的肠道炎性病变，其病理特征为肠绒毛萎缩、隐窝破坏及炎性细胞浸润，临床症状主要表现为厌食、恶心、呕吐、腹泻和腹痛等[1]。CIM不仅直接影响化疗效果，而且降低肿瘤患者的生存质量。目前CIM发病机制尚不明确，且缺乏有效的临床治疗药物。合适的动物模型对疾病研究和药物筛选尤为重要。目前已有多篇化疗诱导动物肠黏膜炎模型的研究报道[2]，其中，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)诱导建立小鼠肠黏膜炎模型方法简便快速，且基本符合患者化疗后胃肠黏膜炎的病理特点，为CIM研究常用动物模型。进一步查阅文献发现，5-FU诱导小鼠肠黏膜炎模型的造模方法主要涉及单次或连续腹腔注射，但其给药剂量差异较大，其中，单次给药剂量范围为100～450 mg/kg[3-6]；连续给药剂量范围为30～150 mg/kg[7-11]。因此，为进一步研究化疗性肠黏膜炎动物模型，本实验模拟了5-FU在临床应用中单次大剂量及分次维持剂量的给药方法[12-14]，观察不同剂量5-FU单次或连续5 d腹腔注射对小鼠肠黏膜损伤的影响。考虑文献报道连续给药周期多为5 d，因此本实验以5 d作为连续给药的周期。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物

SPF级ICR小鼠96只，雄性，体重23～26 g，购买于成都达硕实验动物有限公司【SCXK (川) 2015-030】。饲养于成都中医药大学药学院动物观察室【SYXK(川)2014-124】。动物饲养环境：温度 (25±1)℃，相对湿度 (60±5)%，12 h/12 h 明暗周期交替，标准饲料喂养，自由饮水。

1.1.2试剂与仪器

5-FU(美国Sigma公司，批号WXBC2 167 V)；4%多聚甲醛固定液(北京Biosharp公司，批号1704464)；血细胞分析用溶血剂(上海光电医用电子仪器有限公司，批号17060582)；血细胞分析用稀释液(上海光电医用电子仪器有限公司，批号17070830)等。

Sorvall ST-16R离心机(美国Thermo公司)；BS323S 电子天平(德国Sartorius公司)；全自动血液分析仪(日本光电公司)；光学显微镜(日本Nikon 公司)等。

1.2　方法

1.2.1造模方法

(1)动物分组

96只雄性ICR小鼠适应性饲养3 d，按体重随机分为8组，包括单次给药造模和连续给药造模实验各4组，每组12只。单次给药造模实验分为正常组、5-FU 100 mg/kg组、5-FU 200 mg/kg组和5-FU 400 mg/kg组。连续给药造模实验分为正常组、5-FU 30 mg/kg组、5-FU 50 mg/kg组和5-FU 100 mg/kg组。

(2)模型制作

单次给药造模各组小鼠分别单次腹腔注射5-FU 100、200和400 mg/kg。连续给药造模各组小鼠分别腹腔注射5-FU 30、50和100 mg/kg，连续5 d。正常组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水，给药体积为20 mL/kg。

1.2.2观察指标

(1)一般状态观察

5-FU给药第1天起，每天观察小鼠的体重、饮食、毛色、活动、精神状态及死亡等情况。

(2)小鼠腹泻情况

5-FU给药第1天起，每天观察小鼠腹泻情况，并参考Akinobu Kurita[15]报道方法进行评分：0 分，大便正常或没有；1 分，轻度腹泻，大便可见轻微湿软； 2 分，中度腹泻，大便较湿且不成形并伴有轻度肛周污迹；3 分，重度腹泻，水样便并伴有重度肛周污迹。

(3)小鼠外周血象

单次给药造模和连续给药造模各组小鼠分别于末次给药后72 h 和24 h，小鼠眼底静脉丛取血20 μL，加入预装2 mL稀释液的EP管中，混匀，使用血细胞分析仪检测各组小鼠白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板等血常规指标。

(4)组织病理学观察

单次给药造模和连续给药造模各组小鼠分别于末次给药后72 h和24 h，各处死4只小鼠，剖开腹腔，取距回肠末端3 cm处的回肠2 cm，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片(4 μm)、HE染色，光学显微镜下观察小肠组织结构的病理变化。

1.3　统计方法

2　结果

2.1　一般状态、体重和腹泻观察

正常组小鼠反应灵敏、毛发光泽，饮食及活动均正常。单次或连续给予不同剂量5-FU后，小鼠出现不同程度的腹泻、体重降低、进食减少、毛发枯槁、精神萎靡及活动减少。单次给予5-FU，100、200 mg/kg组无动物死亡，400 mg/kg组小鼠死亡率为63%；连续给予5-FU 5 d后，30 mg/kg组无动物死亡，50、100 mg/kg组动物死亡率分别为38% 和100%。

体重方面，单次或连续给予5-FU后，与正常组比较，各剂量组小鼠体重在第2或3天出现明显降低(P< 0.05或P< 0.01)，其中，单次给予5-FU，400、200 mg/kg组小鼠体重分别在给药后第12或14天仍明显低于正常组(P< 0.05或P< 0.01)；连续给予5-FU 5 d后，50 mg/kg组小鼠在给药后第16天仍有显著差异(P< 0.01)，100 mg/kg组小鼠体重一直持续下降，直至动物死亡。见图1。

腹泻方面，与正常组比较，单次给予5-FU后，100 mg/kg组未出现明显腹泻症状，200、400 mg/kg组小鼠在给药后第3天出现明显腹泻(P< 0.05)，其中，400 mg/kg组腹泻维持时间较长；连续给予5-FU 5 d，各剂量组小鼠在给药第3或4天出现明显腹泻(P< 0.05)，50 mg/kg组腹泻评分在给药后第13天仍有显著差异(P< 0.05)，100 mg/kg组小鼠腹泻一直持续加重，直至动物死亡。见图2。

注：A. 5-FU单次给药对小鼠体重的影响；B. 5-FU连续给药对小鼠体重影响。 与正常组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。图1　5-FU单次及连续给药对小鼠体重的影响Note. A. Single administration of 5-FU. B. Continuous administration of 5-FU. Compared with the control group, *P<0.05; **P<0.01.Fig.1　Effect of single and continuous administration of 5-FU on the body weight of mice n=8)

注：A. 5-FU单次给药对小鼠腹泻评分的影响；B. 5-FU连续给药对小鼠腹泻评分的影响。与正常组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。图2　5-FU单次及连续给药对小鼠腹泻评分的影响Note. A. Single administration of 5-FU. B. Continuous administration of 5-FU. Compared with the control group, *P< 0.05;**P< 0.01.Fig.2　Effect of single and continuous administration of 5-FU on scores of diarrhoea in the mice n=8)

2.2　不同剂量5-FU单次及连续给药对小鼠外周血象的影响

结果见表1和表2。与正常组比较，单次给予5-FU，各剂量组小鼠白细胞和血小板水平均显著降低(P< 0.05或P< 0.01)，红细胞和血红蛋白水平无明显变化；连续给予5-FU 5 d，各剂量组小鼠血小板均明显降低(P< 0.01)，50、100 mg/kg组小鼠白细胞显著降低(P< 0.05或P< 0.01)，100 mg/kg组小鼠红细胞和血红蛋白水平出现明显升高(P< 0.01)。

表1　5-FU单次给药对小鼠外周血象的影响Tab.1　Effect of single administration of 5-FU on peripheral blood of the mice n=8)

注：与正常组比较，*P< 0.05;**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05;**P< 0.01.

表2　5-FU连续给药对小鼠外周血象的影响Tab.2　Effect of continual administration of 5-FU on peripheral blood of the mice n=8)

注: 与正常组比较，*P< 0.05,**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：A. 正常组；B. 5-FU 100 mg/kg组；C. 5-FU 200 mg/kg组；D.5-FU 400 mg/kg组。图3　5-FU单次给药对小鼠小肠组织形态病理改变的影响(HE, ×200)Note. A. Control group. B. 5-FU 100 mg/kg group. C. 5-FU 200 mg/kg group. D. 5-FU 200 mg/kg group.Fig.3　Effect of single administration of 5-FU on pathological changes in the small intestinal tissues of the mice(HE, ×200)

2.3　不同剂量5-FU单次及连续给药对小鼠小肠组织形态病理改变的影响

正常组小鼠肠黏膜组织结构完整，腺体形态完好，绒毛上皮细胞排列整齐，无炎性细胞浸润。单次给予5-FU后，100 mg/kg组小鼠肠绒毛上皮细胞部分脱落；200 mg/kg组可见脱落的绒毛上皮细胞，肠腺结构消失，少量炎性细胞浸润；400 mg/kg组肠绒毛缩短、萎缩，肠腺结构消失，结缔组织增生，可见大量炎性细胞浸润。连续给予5-FU 5 d，30 mg/kg组肠绒毛结构破坏，隐窝细胞数量减少，伴有少量炎性细胞浸润；50 mg/kg组肠绒毛上皮细胞脱落，隐窝结构破坏，可见炎性细胞浸润；100 mg/kg组大量肠绒毛及隐窝结构消失，结缔组织增生，可见大量炎性细胞浸润。结果见图3和图4。

注：A. 正常组；B.5-FU 30 mg/kg组；C. 5-FU 50 mg/kg组；D. 5-FU 100 mg/kg组。　　图4　5-FU连续给药对小鼠小肠组织形态病理改变的影响(HE, ×200)　　Note. A. Control group. B. 5-FU 30 mg/kg group. C. 5-FU 50 mg/kg group. D. 5-FU 100 mg/kg group.Fig.4　Effect of continual administration of 5-FU on pathological changes in the small intestinal tissues of the mice(HE, ×200)

3　讨论

5- FU是临床常用抗消化道肿瘤药物，约80%患者在接受治疗后出现肠黏膜炎[16]，是复制化疗性肠黏膜炎的常见造模药物。本研究前期文献查阅发现5-FU诱导小鼠肠黏膜炎模型的给药剂量差异较大，因此本实验采用不同剂量的5-FU单次或连续5 d腹腔注射给予小鼠，并通过观察小鼠体重、腹泻、外周血象及病理组织形态改变等指标进行综合评价。

实验结果表明，单次或连续5 d给予不同剂量的5-FU，小鼠出现不同程度的腹泻及体重下降。单次给予5-FU，100、200 mg/kg组小鼠腹泻评分偏低，病理损伤较轻，未见或少见炎性细胞浸润；400 mg/kg组小鼠出现明显腹泻，肠绒毛脱落，隐窝消失，可见大量炎性细胞浸润，符合肠黏膜炎病理特征。连续给予5-FU 5 d，30 mg/kg组小鼠未出现明显腹泻，病理损伤较轻，少见炎性细胞浸润；50 mg/kg组小鼠肠绒毛上皮细胞脱落，隐窝结构破坏，可见炎性细胞浸润，且腹泻维持时间较长；100 mg/kg组小鼠出现严重腹泻，大量肠绒毛上皮细胞脱落，隐窝结构消失，但由于剂量过大，动物死亡率高达100%。

此外，骨髓抑制也是化疗常见的不良反应之一，主要表现为白细胞、血小板、红细胞减少，严重时会引起血红蛋白降低甚至全血细胞减少[17]。因而，本研究对外周血象也进行了观察。结果显示，单次给药各剂量组和连续给药30、50 mg/kg组小鼠白细胞和血小板水平均明显降低，红细胞和血红蛋白无明显变化，连续给药100 mg/kg组小鼠白细胞和血小板水平显著降低，红细胞和血红蛋白水平却明显升高。血细胞中红细胞平均寿命最长，血小板次之，白细胞最短，因而，当骨髓造血功能受损后，白细胞及血小板首先受到影响，而对寿命较长的红细胞影响相对滞后。本实验主要观察到白细胞和血小板水平下降，推测可能与此有关。同时，本研究中连续给药5-FU 100 mg/kg引起红细胞升高，可能与白细胞和血小板急剧减少，造血干细胞更多分化为红系祖细胞，进而导致红细胞暂时升高有关，但还需进一步证实。

综上所述，单次或连续5 d给予5-FU 诱导小鼠肠黏膜炎的作用呈剂量相关性，其中单次给药以400 mg/kg为造模合适剂量，连续5 d给药以50 mg/kg为造模合适剂量。