戊己丸对炎症后肠易激综合征大鼠脑肠肽的调控作用

黄鹤飞，强伟杰，杨庆，李玉洁，翁小刚，王娅杰，李琦，蔡维艳，陈涛,朱晓新*，陈颖*

(1.中国中医科学院中药研究所，北京　100700； 2. 三峡大学，湖北 宜昌　443002;3．三峡食品药品检验检测中心，湖北 宜昌　443002)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种临床常见的以腹痛、腹部不适和大便习惯改变为主要特征的慢性功能性肠道病变，属中医“腹痛”、“泄泻”范畴；其因为外感时邪，内伤饮食或情志所伤等致脏腑功能失调，从而肠道气机不利、传导失司而导致痛、泻等症。IBS病程渐进、迁延难愈、常易复发。IBS全球发病率约为10%～30%，我国患病率在20%左右[1]。近年来随着生活节奏增快和压力增大，发病率有上升的趋势。

临床主要依据“IBS罗马Ⅲ诊断标准”进行症状学诊断。但是目前对IBS诊断标准的解释和应用存在较强的主观性，缺乏特异性的形态学或生物化学的诊断标识。2016年颁布的《罗马Ⅳ：功能性胃肠病》中认为包括IBS在内的功能性胃肠道疾病是“脑-肠互动障碍相关的疾病，其病因可能包括动力紊乱、内脏高敏感、黏膜和免疫功能改变、肠道菌群改变和神经中枢系统处理过程的改变”。这种疾病定义的变更与新的脑-肠交互观点更为吻合。传统中医认为胃肠疾病与“心”相关：“脑为奇恒之府；大肠为传化之腑；浊气出，精汁藏，则脏腑得养，气机调畅，神乃正常；胃不和则卧不安；久虑伤脾”[2]；因此在治疗脾胃相关疾病时需要“心胃”并治[3]。脑肠肽(brain-gut peptides，BGP)是指一类既存在胃肠道又存在于脑组织内，参与生理活动的物质，包括神经递质、胃肠激素等，因大多为肽类故称为脑肠肽。在脑肠轴的交互作用中，BGP作为兼有神经递质和激素双重作用的重要功能因子，起到搭建连接桥梁和调控功能的作用。目前发现的BGP有60余种，与IBS有密切关系的有降钙素基因相关肽(CGRP)、胃动素(MTL)、神经肽Y(NPY)、P物质(SP)、生长抑素(SS)、血管活性肠肽(VIP)、胆囊收缩素(CCK)等。

在IBS的脑肠交互研究中，BGP逐渐成为研究的热点，但是尚未有IBS动物模型的中枢和肠道BGP的变化的系统研究。本文拟从BGP调节的角度，研究戊己丸对IBS的调控作用，将对理解IBS的发病机制，揭示药物作用的新靶点，为IBS的临床诊断和治疗方法的发现提供基础。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物

SPF级SD大鼠60只，雄性，(250±20)g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心【SCXK(军)2012-0004】。在中国中医科学院中药研究所动物室屏障环境【SYXK(京)2013-0035】进行实验，实验过程按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀，并通过中国中医科学院中药研究所动物实验伦理审查(伦理审批号：20150410-01)。

1.1.2仪器和试剂

Potter S型匀浆机，Spectra max Plus384微孔板检测系统，CGRP、MTL、NPY、SP、SS、VIP、CCK的ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)，戊己丸(含黄连:制吴茱萸:炒白芍为6∶1∶6；黄连、制吴茱萸和土炒白芍提取物由中日友好医院药剂室制备，为真空干燥固体粉末，得率分别为19.3%，17.7%，9.37%)，匹维溴铵片(法国苏威制药厂)。

1.2　方法

1.2.1实验分组

随机将大鼠分为6组：为正常组对照(NC)，模型组(M)，阳性药组(PC)，戊己丸低(W-L)、中(W-M)、高剂量组(W-H)，每组10只。除正常组动物外，均采用单笼饲养，自由饮食，12 h/12 h黑暗与光照交替，室温24℃。大鼠在造模成功后，给予以临床1、2、4倍量戊己丸提取物为低剂量(630 mg/kg)、中剂量(1260 mg/kg)、高剂量(2520 mg/kg)药物组；阳性药组给予匹维溴铵13.5 mg/kg，以20 mL/kg灌胃给药；正常组、模型组均给予等量蒸馏水。每天8点灌胃给药，持续给药7 d。

1.2.2PI-IBS大鼠模型的建立及结肠运动能力检测[4]

大鼠禁食12 h后，经肛门插入8 cm深硅胶管，灌入1 mL的4%乙酸水溶液，将尾部抬高30 s，然后注入1 mL的生理盐水冲洗结肠。乙酸刺激后的第8天用胶带束缚大鼠的上半身(包括前肩、前上肢、胸部)，限制大鼠前上肢抓挠头面部，但不限制其活动，束缚时间为1 h。分别于建模前、给药前及给药后测量以下指标。

大鼠2 h内排便的粪粒数：清早未刺激前计2 h内大鼠排便的粪粒数。

大鼠结肠运动的描记：将橡胶小囊与直径为2 mm的塑料导管连接，将塑料导管与三通管(一端接压力换能器，另一端接1 mL的注射器)连接，注射器注入水，排净气泡，将压力换能器与多导生理记录仪相连，记录30 min结肠运动的曲线。然后计算连续30 min的曲线下面积为大鼠的结肠运动指数(motility index，MI)。

大鼠直肠内玻璃小球排出时间：取玻璃小球(直径3 mm)放入距肛门3 cm的直肠内，移至垫清洁滤纸的笼内喂食饮水，计时。计算直肠内玻璃小球排出时间。

1.2.3样品采集及指标检测

实验结束后，麻醉后取脑组织。量取距肛门8 cm处取结肠组织2 cm。加3倍体积生理盐水匀浆后，按照ELISA试剂盒的操作说明检测CGRP、MTL、NPY、SP、SS、VIP、CCK的含量。样品体积50～100 μL，检测波长为450 nm。

1.3　统计学处理

应用SPSS 13.0软件进行统计分析，结果以均数±标准差来表示，各组间均数比较采用t检验。

2　结果

2.1　动物一般状态

与正常大鼠比较，PI-IBS模型大鼠体重降低、摄食量减少、排便量增多、出现稀便和无定形软便、自主运动量减少。戊己丸和阳性药治疗7 d后，大鼠体重和摄食量均增加；排便量减少；稀便减少；自主运动量接近正常。

2.2　结肠运动能力

2.2.1大鼠2 h内排出的粪粒数

造模前，各组大鼠2 h内排出的粪粒数无差异。造模后，PI-IBS大鼠排出的粪粒数较正常组显著增加(P< 0.05)。戊己丸或阳性药治疗后，大鼠2 h内排出粪粒数显著降低(P< 0.05)。结果见图1。

注：与正常组比较，*P< 0.05；与模型组比较，#P< 0.05。图1　大鼠2 h内排出的粪粒数Note. Compared with the control group, *P< 0.05; Compared with the model group, #P< 0.05.Fig.1　The number of fecal pellets discharged within 2 h of the rats

2.2.2大鼠结肠运动变化

造模前，各组大鼠的MI无差异。造模后，PI-IBS大鼠结肠MI较正常大鼠显著增加(P< 0.05)。戊己丸或阳性药治疗后，与PI-IBS模型大鼠比较，戊己丸中、高剂量组和阳性药组大鼠的MI值显著降低(P< 0.05)。结果见图2。

2.2.3大鼠直肠内玻璃小球排出时间

造模前，各组大鼠的玻璃小球排出时间无差异。造模后，PI-IBS大鼠直肠内玻璃小球排出时间较正常大鼠显著缩短(P< 0.05)。戊己丸或阳性药治疗后，与PI-IBS模型大鼠比较，戊己丸各给药组和阳性药组大鼠直肠玻璃小球排出时间显著增加(P< 0.05)。结果见图3。

注：与正常组比较，*P< 0.05；与模型组比较，#P< 0.05。图2　大鼠结肠运动指数(MI)Note. Compared with the control group, *P< 0.05; Compared with the model group, #P< 0.05.Fig.2　Distal colon motility index (MI) of the rats

注：与正常组比较，*P< 0.05；与模型组比较，#P< 0.05。图3　大鼠直肠内玻璃小球排出时间(s)Note. Compared with the control group, *P< 0.05; Compared with the model group, #P< 0.05.Fig.3　Glass pellet discharge time (s) of the rats

2.3　对结肠组织中脑肠肽的影响

与正常大鼠比较，PI-IBS大鼠结肠组织中CGRP、MTL、NPY、SP、SS、VIP和CCK水平均显著降低(P< 0.05)；阳性药可显著逆转NPY、VIP和CCK水平的降低(P< 0.05)；中剂量的戊己丸给药后，结肠组织中的NPY和VIP可显著增加(P< 0.05)。结果见图4。

2.4　对大鼠脑组织中脑肠肽的影响

与正常大鼠比较，PI-IBS大鼠脑组织中CGRP、MTL、SS和VIP显著增加(P< 0.05)；阳性药组可显著逆转脑组织中MTL、SS和VIP水平的升高(P< 0.05)；戊己丸中、高剂量组显著降低CGRP、MTL、SS和VIP水平(P< 0.05)。与正常大鼠比较，PI-IBS大鼠脑组织中NPY和SP显著降低。戊己丸高剂量给药后，NPY水平有显著的升高(P< 0.05)。结果见图5。

3　讨论

本研究采用乙酸灌肠联合束缚应激法建立的PI-IBS大鼠模拟了临床上PI-IBS患者的大部分典型症状。在灌注乙酸后三天，大鼠均出现严重的腹泻；随着时间的延长，腹泻症状均有不同程度的缓解；到乙酸灌肠后第7天进行胃肠动力检测发现大鼠的结肠运动显著增强，排便及大便性状异常，同时病理学结果表明结肠黏膜完整，无器质性损害。这些症状也与现有的最新临床诊断标准(罗马IV)中描述的很一致。戊己丸是具有泻肝和胃，降逆止呕之功效的经典名方，被中国药典2010版收录，用于治疗肝火犯胃，肝胃不和所致的胃脘灼热疼痛，口苦嘈杂、呕吐吞酸，腹痛泄泻等症状。在我们的前期研究中，发现其能显著改善IBS患者和模型动物的腹泻、腹痛等症状，还具有改善感染后的肠壁紧密连接改变所导致的肠黏膜通透性的改变，调控肠道微生物菌群的平衡，改善肠黏膜免疫功能等作用[4]。

注：(A)大鼠结肠组织中CGRP含量；(B)大鼠结肠组织中MTL含量；(C)大鼠结肠组织中NPY含量；(D)大鼠结肠组织中SP含量；(E)大鼠结肠组织中SS含量；(F)大鼠结肠组织中VIP含量；(G)大鼠结肠组织中CCK含量。与正常组比较，*P< 0.05；与模型组比较，#P< 0.05。图4　大鼠结肠组织中脑肠肽含量Note: (A) Content of CGRP. (B) Content of MTL. (C) Content of NPY. (D) Content of SP. (E) Content of SS. (F) Content of VIP. (G) Content of CCK. Compared with the control group, *P<0.05; Compared with the model group, #P<0.05.Fig.4　Contents of brain-gut peptides in the rat colon tissues

注：(A)大鼠脑组织中CGRP含量；(B)大鼠脑组织中MTL含量；(C)大鼠脑组织中NPY含量；(D)大鼠脑组织中SP含量；(E)大鼠脑组织中SS含量；(F)大鼠脑组织中VIP含量；(G)大鼠脑组织中CCK含量。与正常组比较，*P< 0.05；与模型组比较，#P< 0.05。图5　大鼠脑组织中脑肠肽含量Note. NC: (A) Content of CGRP. (B) Content of MTL. (C) Content of NPY. (D) Content of SP. (E) Content of SS. (F) Content of VIP. (G) Content of CCK. Compared with the control group, *P< 0.05;Compared with the model group, #P< 0.05.Fig.5　Contents of brain-gut peptides in the rat brain tissues

IBS与肠神经系统(ENS)和中枢神经系统(CNS)及脑肠轴功能失调密切相关。ENS是分布于胃肠道的一个巨大网络，通过各种BGP的释放和传递，把内脏与中枢关联起来。这些同时在中枢和外周分泌的BGP，一方面作为神经传递和调节的介质调节内脏感觉和运动；另一方面在胃肠道的分泌起重要的调节作用。如CGRP由初级感觉神经元释放，参与疼痛信号的传导过程；MTL主要存在于十二指肠和近端空肠黏膜隐窝及绒毛中，少量存在于胃窦及下部小肠黏膜中[5]，可作用于消化道平滑肌细胞，促进胃肠运动，增强水以及电解质的运输；MTL可促进胰多肽和SS的释放从而引起胃肠动力改变。NPY及其受体在CNS的痛觉调制中起重要作用。在CNS中，NPY可调节下丘脑激素的合成与释放；在外周器官交感神经末梢，NPY与去甲肾上腺素共存，参与对胃肠道的功能调节。SP是连接中枢和免疫的一种信号传导分子。在ENS，SP存在于多肽神经元中，可以增加胃肠蠕动，激活释放5-HT和组胺[6]。SP还能够刺激和加速胃肠蠕动，向脑内痛觉中枢传递痛觉信息。SS由胃肠D细胞分泌，可抑制胃肠和胆道平滑肌的活动，抑制胃酸的分泌。VIP可抑制胃肠道环形平滑肌[7]，VIP还可刺激胃肠黏膜分泌细胞，增加水、电解质的黏膜分泌，继而出现腹泻及黏液便[8]。CCK可使胆囊和胃肠平滑肌收缩，调节多种神经递质，并影响迷走传人神经途径中其他激素的信号转导。这些脑肠肽虽然已经被证实可以被传递到靶细胞传递信息，通过内分泌系统影响神经系统和胃肠道的功能，但是，这些脑肠肽指标变化与疾病发病机制的关系，以及涉及到的具体作用机制还很不明确。从文献可见[9-12]：IBS病人或疾病模型的血浆/血清、脑组织和肠道组织内的脑肠肽与正常组相比具有显著的改变；大多脑肠肽在循环系统的变化趋势与肠道组织中的一致。脑和肠道组织的样本在临床上很难得到。因此，血清/血浆中的脑肠肽有可能作为一个潜在的指标，为IBS疾病的诊断及药效的判定提供实验支持。

本研究建立的PI-IBS大鼠的结肠组织和脑组织内多种脑肠肽的水平均有显著的变化，提示这些脑肠肽在脑-肠中可能参与IBS的病理生理过程。由于目前对IBS的具体的发病机制尚不明确，脑肠肽调节IBS研究仅有5-羟色胺信号系统受到了较多的关注。大多数脑肠肽的变化是涉及到哪些信号通路以及与疾病机制的关系还很不明确，仍然需要进一步从分子生物学层面进行研究。本研究中可被调节的异常变化的脑肠肽可能成为潜在的诊断和治疗IBS的生物学指标，可进一步应用于治疗IBS药物的作用机制研究。

研究结果表明：基于“泻肝和胃，降逆止呕”理论的戊己丸方能够改善该IBS大鼠的症状，同时也具有明显的调节脑肠肽的作用。戊己丸对脑组织中的SS、NPY、CGRP、SP、VIP具有调节作用，其中对SS、NPY、CGRP、VIP作用显著；对结肠组织中的CGRP、MTL、NPY、SS、VIP具有调节作用。进一步研究戊己丸对各种脑肠肽影响的作用机制，以及戊己丸主要有效成分与脑肠肽的PK-PD相关性将有利于阐释中药复方治疗IBS的作用机制，为寻找治疗IBS的药物作用靶点提供指导。