一种体外皮肤腐蚀性试验替代方法的建立

罗飞亚，张露勇，邢书霞，王钢力

(中国食品药品检定研究院，北京　100050)

近年，随着动物福利和动物保护的“3R”(减少Reduction、优化Refinement、替代Replacement)原则的提出，以及世界范围内化妆品及化学品动物试验禁令的推行[1-5]，在毒理学安全性评价领域中，动物替代检测技术受到特别的关注[6-10]。大鼠经皮电阻试验(transcutaneous electrical resistance test，TER)是利用大鼠背部离体皮肤检测腐蚀性，与传统的家兔试验相比，TER减少动物数量、减轻动物痛苦，符合“3R”原则[11-12]。目前国内对该方法的建立和使用报道还较少[13-14]，本研究在参照经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD) 化学品安全性检测指南的基础上，对TER结果判定的程序进行改良和验证。该方法在2017年8月被国家食品药品监督管理总局纳入《化妆品安全技术规范》(2015版)[15]，作为化妆品用化学原料皮肤腐蚀性的替代检测方法[16]。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物

SPF级Wistar种大鼠，鼠龄18～21 d，体重60～80 g，由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心提供【SCXK(京)2014-0013】。动物试验环境条件为屏障环境【SYXK(京)2016-0004】，温度22～24℃，相对湿度50%～70%，动物自由饮食，日光灯12 h照明。大鼠皮肤应健康无破损，实验前动物在实验动物房环境中至少适应3 d。

1.1.2试剂

从OECD推荐的参考物质及实验室常用皮肤腐蚀性化妆品原料中选择了16种已知皮肤腐蚀性的化学物质作为受试物，包括：4-氨基-1,2,4-三氮唑(TCI)、丁子香酚(国药集团北京分公司)、溴乙基苯(Alorich)、四氯乙烯(国药集团北京分公司)、异硬脂酸(Adamas)、4-甲硫基-苯甲醛(TIC)、异丙醇(国药集团北京分公司)、月桂酸(国药集团北京分公司)、十二烷基硫酸钠(SDS, 20% w/v, Sigma)、N,N-二甲基亚二丙基三胺(Adamas)、邻叔丁基苯酚(TCI)、氢氧化钾(10% w/v，国药集团北京分公司)、硫酸(10% w/v，国药集团北京分公司)、辛酸(国药集团北京分公司)、1,2-丙二胺(国药集团北京分公司)、丙烯酸(国药集团北京分公司)。以盐酸(10 mol/L、8 mol/L)作为阳性对照，去离子水作为阴性对照。同时，去离子水作为溶剂，配制电解液(154 nmol/L MgSO4)、罗丹明B染料(10% w/v SRB)、染料萃取液(30% w/v SDS)。

1.1.3仪器

大鼠经皮电阻仪委托北京华清天禧医药科技有限公司研制，仪器参数符合OECD指南要求(工作电压220 V，50 Hz，交流电，工作电极为2根216惰性银电极)，皮肤固定装置选用聚四氟乙烯参照OECD指南装置示意图及尺寸要求制作[11]。

1.2　方法

1.2.1大鼠经皮电阻仪24 h稳定性

选取同一只Wistar大鼠(29 d)背部靠近脊柱两侧的皮肤，将皮肤固定于蜡板上，剃除被毛及多余的脂肪组织，制成直径约20 mm的小皮片5～6块，将小皮片表皮面向上固定在聚四氟乙烯管末端，剪去多余皮肤。在24 h内分别选取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、20、22、23和24 h的时间点，对大鼠皮片进行电阻值(TER)读数，该过程重复3次，统计结果。

1.2.2大鼠经皮电阻试验[11-12]

选用22 d龄的Wistar雄性大鼠，剃去背部和两侧被毛，间隔3 d以含抗生素溶液浸洗去毛区2次，第29天时牺牲大鼠(大鼠牺牲时间必须在第28～30天内)，剪取去毛区皮肤，小心剔除皮下脂肪，表皮面向上以胶圈固定于大鼠经皮电阻仪的皮肤固定装置上(聚四氟乙烯管)，剪去多余皮肤。试验前向管内加入1 mL硫酸镁溶液(154 mmol/L)，接上电极测定TER值，大于20 kΩ者可用。

液体受试物150 μL直接加入管内皮片的表皮面，固体受试物先研磨成细粉，取足量(约100 mg)撒在皮片上，再加150 μL去离子水润湿。加样的皮片室温静置24 h后以流水轻柔地冲洗以去除受试物，用洗瓶向皮片表面滴加足量体积分数为70%的乙醇，5 s后去除乙醇，再以流水清洗。尽量去除净受试物后，向管内加入1 mL硫酸镁溶液，接上电极测定TER值。记录TER值后，去除管中的硫酸镁溶液，肉眼检查并纪录皮片的损伤情况。

1.2.3罗丹明B(SRB)染料渗透量测定

向管内皮片表面滴加150 μL 10% SRB水溶液，室温静置2 h，以流水轻柔的冲洗皮片，去除多余的SRB，小心的将皮片取下，放入含8 mL双蒸水的离心管中轻柔震摇5 min，换干净的双蒸水重复清洗1次，将皮片放入5 mL 30%的SDS水溶液中，60℃水浴提取过夜，去除皮片，剩余提取液以1900 r/min离心8 min(相对离心力175g)，取上清液1 mL加4 mL30% SDS溶液至5 mL，测吸光值(λ= 565 nm)。

1.2.4结果判定标准方案

标准方案S：按OECD TG430的判定程序，TER > 5 kΩ为非腐蚀性(NC)；对于TER ≤ 5 kΩ且肉眼观察皮片有明显损伤判为腐蚀性(C)；TER ≤ 5 kΩ且肉眼观察皮片没有明显损伤的进行染料渗透量测定；染料渗透量大于或等于10 mol/L盐酸的为C，染料渗透量小于10 mol/L盐酸的为NC。

调整方案A：程序同方案S，而判定界值改为15 kΩ。

调整方案B：TER>15 kΩ为NC，TER<5 kΩ且肉眼观察皮片有明显损伤判定为C；TER为5 ～15 kΩ且肉眼观察皮片未见明显损伤的，或3个平行样的TER值在界值(5、15 kΩ)上下波动的或肉眼可见皮片明显破损、变色、变硬等可疑情况，需进行染料渗透量测定，染料渗透量大于或等于10 mol/L盐酸的为C，染料渗透量小于10 mol/L盐酸的为NC。

调整方案C：程序同方案S，而染料渗透量判定标准为8 mol/L盐酸。

调整方案D：程序同方案A，而染料渗透量判定标准为8 mol/L盐酸。

关于“名从主人”原则在实施时遇到的问题，李捷、何自然有专文谈到五点对策：一、音从主人；二、音、义从主（即音意结合的翻译）；三、音、形从主（即不译照搬）；四、形从主人（原文照搬，但发音按目的语读）；五、重命名（例如北京航空航天大学译为Beihang University）。[2]这番讨论说明“名从主人”不止和音译相关。

调整方案E：程序同方案B，而染料渗透量判定标准为8 mol/L盐酸。

1.2.5实验室间比对

在实验室建立TER试验方案后，选取11种参考物质发送至另外4家实验室进行TER检测，其中3家实验室使用本实验室相同的大鼠经皮电阻仪，1家实验室使用自主研发的大鼠经皮电阻仪[17]。收集4家实验室的数据并统一以方案B的判定标准判定结果，对比各实验室的结果。

2　结果

2.1　大鼠经皮电阻仪24 h仪器稳定性结果

正常大鼠皮片TER值变化如图1所示，在皮片置于皮肤固定装置后2～10 h内，TER值明显降低，24 h后稳定在15～30 kΩ。3次重复试验TER值变化趋势一致。

2.2　TER各方案腐蚀性结果判定及真实性分析

依据不同的判断方案，采用TER方法对16种参考物质进行腐蚀性判断，结果如表1所示，参考物质的腐蚀性强弱与TER值存在一定关联性。TER值越高，其腐蚀性越弱。阴性对照(双蒸水)TER平均值为18.36 kΩ，符合OECD操作指南的参考数据(10～25 kΩ)，阳性对照10 mol/L盐酸的TER平均值3.93 kΩ，8 mol/L盐酸的TER平均值3.35 kΩ，略高于OECD的参考数据(0.5～1.0 kΩ)。OECD操作指南的标准判定方案规定当TER > 5 kΩ时，且皮片肉眼观察无明显损伤，受试物直接判定为非腐蚀性。在本研究中，大鼠经皮电阻仪的读数均偏高，很多腐蚀性参考物质的TER值大于5 kΩ且肉眼观察皮片无损伤，但是通过罗丹明B染色后，染料渗透量大于阳性对照组的染料渗透量，符合OECD对罗丹明B染色结果腐蚀性的判定。此外，OECD指南中指出如采用新的仪器检测，可能会改变判定界值，需要进一步验证。因此，基于本研究所使用的大鼠经皮电阻仪，对判定程序进行了调整，设定了方案A-E，通过比较不同方案的真实性指标(表2所示)，并将几种方案的判定结果经过配对x2检验与这16种参考物质的实际皮肤腐蚀性数据相比，方案B和C差异均无显著性(P> 0.05)。以B方案的效能最高，特异性为66.7%，敏感性为100%，具有一致性(Kappa=0.64)。综上，仅以TER值是否小于5 kΩ判断受试物的腐蚀性是不够的，进行第二步罗丹明B染色是必要的；除非肉眼观察到皮片损伤，否则应结合罗丹明B染色结果判定受试物的腐蚀性。

综上所述，经额下入路手术切除鞍结节脑膜瘤的总体疗效较好，术后复发率较低。对于肿瘤直径较大、手术切除程度低的患者应警惕复发的危险。

表1　参考物质腐蚀性结果的对比Tab.1　Comparison of the results of reference chemical skin corrosiveness

注：C：腐蚀性；NC：非腐蚀性；各受试物经皮腐蚀性为UN GHS目录中基于体内数据判定的结果；No：未观察到皮片损伤；Yes：观察到皮片损伤；-：未测定。

Note.C: Corrosive. NC: None corrosive. The corrosions were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults.[18]No：There is no obvious damage on skin slice. Yes：There is obvious damage on skin slice.-:Untested.

表2　各判定方案对大鼠经皮电阻试验结果判定的真实性指标分析(%)Tab.2　The authenticity characteristics analysis for TER results by using different program interpretations(%)

注:*: 所有结果与各受试物参考腐蚀性数据进行比对。

Note.*. All results compared with the reference corrosive parameters of the tested substance.

2.3　实验室间比对结果

收集各实验室数据，统一采用方案B对各11种参考物质的腐蚀性进行判定，结果如表3所示。其中实验室1～4采用的大鼠经皮电阻仪均为北京华清天禧公司提供的仪器，实验室5为自主研发的大鼠经皮电阻仪[17]。实验室间比对结果显示，丁子香酚、异丙醇和20% SDS均有假阳性结果出现，邻叔丁基苯酚有假阴性结果出现，其余参考物质的皮肤腐蚀性判定一致并与参考物质本身的腐蚀性相符，所有参考物质在5个实验室中的判定一致率为72.7%。其中20% SDS在所有实验室中均检测为假阳性，可能是TER方法对该表面活性剂类物质过度判断。对各实验室判定结果进行一致率两两对比(表4)，各实验室对同一种参考物质的腐蚀性判定一致率在72.7%～90.9%，说明实验室间重复性较好。各实验室结果与参考物质的腐蚀性数据经过配对x2检验差异均无显著性(P> 0.05)，说明各实验室对参考物质的腐蚀性判定结果可靠。

表3　皮肤腐蚀性实验室间比对结果Tab.3　The skin corrosiveness results of different laboratories

注：C：皮肤腐蚀性；NC：非皮肤腐蚀性。*: 各受试物经皮腐蚀性为UN GHS目录中基于体内数据判定的结果。

Note. C. corrosive to skin; NC. non-corrosive to skin.*.The results were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults. (UN GHS 2007)[18]

表4　实验室间一致率比对结果分析(%)Tab.4　The reproducibility analysis for TER results between different laboratories

3　讨论

皮肤腐蚀性/刺激性是化妆品安全性评价中较为重要的毒理学终点之一，OECD操作指南中皮肤刺激性/腐蚀性的替代试验只有3类：大鼠经皮电阻试验(OECD TG 430)[11]、体外皮肤腐蚀性/刺激性的重组人表皮模型试验(OECD TG 431/439)[19-20]和体外皮肤腐蚀性膜屏障试验(OECD TG 435)[21]。与传统的动物试验[14、22]相比，TER方法减少动物用量，减轻动物痛苦，符合动物伦理3R原则；与其他OECD认可的替代试验相比，TER方法具有操作简便、试验成本低、试验材料容易获取等优点。TER方法更适宜用于大量粗筛腐蚀性强的物质，但对腐蚀性强弱无法量化评级。

根据OECD TG430的标准，判定受试物是否为非腐蚀性的标准为电阻值(TER)大于5 kΩ，然而在实际检测中发现，使用本课题研发的大鼠经皮电阻仪，检测阳性物质的电阻值往往大于5 kΩ，且肉眼很难分辨皮片是否需要进行染料渗透量测定，该结果与大鼠经皮电阻仪读数范围相关。在OECD操作指南中[11]，对大鼠经皮电阻仪的参数要求为惠斯通电桥，使用正弦或方波交流电频率为50～1 000 Hz，但实际在仪器研发中发现，交流电频率会影响读数的稳定及读数范围[17]，而OECD规定的电流频率较广，虽然本实验中所使用的经皮电阻仪各项参数均符合OECD的指南要求，但检测出的电阻值读数仍会出现偏高的情况。另一方面，OECD指南内也指出可根据仪器适当调整判断界值，因此建议在实验室内建立TER试验方法时，应通过检测参考物质的电阻值，并分析实验室内参考物质和对照组的数据，适当调整判断基准。针对本实验研制的大鼠经皮电阻仪，经过现有数据分析，认为应在TER读数为5～15 kΩ且肉眼未观察到明显破损时，不省略罗丹明B染色的步骤，应结合染料渗透量的结果进一步确证受试物的腐蚀性，如有必要还可进行病理研究，观察皮肤被腐蚀的程度，以支持腐蚀性的结果判断。但目前只能说对于本研究使用的16种参考物质有效，对于其他化学物质的腐蚀性判断是否合适，或是否有更合理的判定标准，仍需扩大研究范围。在选取参考物质时，应同时考虑化学物质的理化性质(有机酸、无机酸、液体、固定、表面活性剂等)、是否具有明确的腐蚀性数据、是否是可购买到的常规试剂，力求尽可能具有代表性。

OECD推荐的阳性对照物为10 mol/L盐酸，但在实验中发现10 mol/L盐酸容易造成皮片破裂而无法进行阳性对照组的染色，影响受试物染料渗透量的判定，因此可增加不会蚀穿皮肤的最高盐酸浓度(如本研究的8 mol/L盐酸组)作为阳性对照组。此外，大鼠皮片的质量控制及其在染毒的24 h内所处环境的湿度可能影响皮片状态，从而影响TER值的读数，这些方面仍有待进一步研究。

(致谢：感谢北京市药检所[23]、浙江省食品药品检验研究院、广东省疾病控制中心、中国检验检疫科学研究院综合检测中心参与协助进行实验室间比对检测。感谢国家食品药品监督管理总局对本研究的支持。)