甘草酸对癫痫大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机制

魏　强，程　洁，胡玉敬，边艳珠*，董长征

(1.河北省人民医院核医学科，石家庄　050051； 2.河北省人民医院口腔科，石家庄　050051； 3.河北省人民医院神经外科，石家庄　050051)

癫痫是一种临床上表现为反复性、刻板性、暂时性及发作性的脑部疾病。由于感觉、意识、精神、运动、行为等发生了功能性障碍，给患者带来沉重的心理及生理负担[1-3]。因此深入的研究癫痫的发病机制及新治疗药物的开发至关重要。甘草酸是从甘草中提取出来的一种活性三萜皂苷类物质，具有保肝、降血脂、降血压、抗病毒、免疫调节等作用[4-5]。同时，相关研究显示甘草酸也具有神经保护作用[6-7]，还发现甘草酸作为高迁移率族蛋白1抑制剂能够减轻癫痫对大鼠血脑屏障完整性的破坏[8]，但对于甘草酸是否能够抑制癫痫引起大鼠海马神经损伤尚未见报道，因此本研究将对此展开探讨。

1　材料和方法

1.1　实验动物

清洁级SD雄性大鼠45只，4周龄，体重(200±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2012-0002]；实验在河北省人民医院实验动物中心进行[SYXK(冀)2013-0056]。温度21℃～25℃，自由饮食饮水，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2　主要试剂及仪器

BCA法蛋白定量试剂盒，细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒，小鼠抗GAPDH单克隆抗体，Nissl染色试剂盒，细胞膜电位检测试剂盒，caspase 3，9活性检测试剂盒，TUNEL试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；兔抗cleaved caspase 3、9、Bax、Bcl-2、CytC、Apaf-1多克隆抗体均购于美国Abcam公司；BX53荧光显微镜购于美国Olympus公司；转印电泳仪，GelDocEZ凝胶成像系统均购于美国Bio-Rad公司。

1.3　实验方法

1.3.1癫痫模型的制备[9-10]

取33只大鼠腹腔注射127 mg/kg氯化锂，24 h后腹腔注射1 mg/kg阿托品，30 min后腹腔注射30 mg/kg匹鲁卡品，并观察大鼠行为，同时根据国际通用癫痫发作Racine分级进行判断，达到 IV级以上的说明癫痫点燃模型成功。大鼠癫痫持续发作30 min后给予10 mg/kg地西泮，直至癫痫发作终止，从而对癫痫进行控制。其中癫痫发作4级以上的大鼠有28只，3级以下的有3只，2只在造模过程中死亡。

1.3.2分组及给药

将造模成功的28只大鼠随机选取24只分为癫痫组及甘草酸组，另外选取12只不做任何处理的大鼠作为正常对照组，甘草酸组在造模成功后灌胃给予30 mg/kg甘草酸，癫痫组及正常对照组给予等量生理盐水，连续给药7 d。大鼠麻醉后断头取脑组织，并在4℃条件下钝性分离大鼠双侧海马组织，在液氮罐中保存待测。

1.3.3Nissl法检测细胞损伤

海马组织切片于二甲苯、100%、95%、80%、70%酒精中浸泡2 min后，PBS洗涤，1%甲苯胺蓝染色40 min，后分色，二甲苯、梯度酒精透明，封片，最后于显微镜下观察并对尼氏阳性的细胞进行计数。

1.3.4TUNEL法检测细胞凋亡

将海马组织切片置于二甲苯、100%、95%、90%、80%、70%的酒精中各浸泡5 min，后蛋白酶K室温消化1 h、PBS洗涤3次，按TUNEL反应试剂盒步骤对切片进行染色、终止反应、封片等，最后于荧光显微镜下观察洗涤凋亡数目。经TUNEL染色上的阳性细胞呈棕黄色或棕褐色。

1.3.5比色法检测caspase 3、9活性

将海马组织匀浆后加入胰蛋白酶裂解，离心收集上清液，按caspase 3、9活性检测试剂盒说明书检测海马组织中caspase 3、9活性。

1.3.6Western blot检测cleaved caspase 3、9、Bax、Bcl-2、CytC、Apaf-1蛋白表达将海马组织匀浆后加入细胞裂解液裂解30 min，离心收集上清液即是总蛋白，测定蛋白浓度并定量，变性。制作浓缩胶及分离胶，蛋白上样，进行十二烷基苯磺酸钠电泳，转PVDF膜，一抗溶液(兔抗cleaved caspase 3、9、Bax、Bcl-2、CytC、Apaf-1多克隆抗体)孵育，4℃过夜；二抗室温孵育1～2 h。在凝胶成像系统中曝光。

注：与正常对照组比较，**P< 0.01；与癫痫组比较，##P< 0.01。下同。图1　甘草酸对癫痫大鼠海马神经元损伤及凋亡的影响(×200，n=6)Note. Compared with the normal control group,**P< 0.01. Compared with the epilepsy group,##P< 0.01.The same below.Fig.1　Effect of glycyrrhizic acid on hippocampal neuron injury and apoptosis in epileptic rats

1.4　统计学方法

2　结果

2.1　甘草酸对癫痫大鼠海马神经元损伤及凋亡的影响

与正常对照组比较，癫痫组神经元细胞数目减少、TUNEL阳性细胞数目增加(P< 0.01)；与癫痫组比较，甘草酸组神经元细胞数目增加、TUNEL阳性细胞数目减少(P< 0.01)。(图1)

2.2　甘草酸对癫痫大鼠海马神经元线粒体膜电位的影响

癫痫组海马神经元细胞线粒体膜电位较正常对照组降低(P< 0.01)；甘草酸组海马神经元细胞线粒体膜电位较癫痫组增加(P< 0.01)。(图2)

图2　甘草酸对癫痫大鼠海马神经元线粒体膜电位的影响(n=6)Fig.2　Effect of glycyrrhizic acid on mitochondrial membrane potential in hippocampal neurons of epileptic rats

2.3　甘草酸对癫痫大鼠海马组织中Caspase 3、9活性的影响

癫痫组caspase 3、9活性较正常对照组提高(P< 0.01)；甘草酸组caspase 3活性较癫痫组降低(P< 0.01)。(表1)

表1　甘草酸对癫痫大鼠海马组织中

2.4　甘草酸对癫痫大鼠海马组织中cleaved-caspase 3、9蛋白表达的影响

与正常对照组比较，癫痫组cleaved-caspase 3、9表达量上调(P< 0.01)；与癫痫组比较，甘草酸组cleaved-caspase 3、9表达量下调(P< 0.01)。(图3)

图3　甘草酸对癫痫大鼠海马组织中c leaved-caspase 3、9蛋白表达的影响(n=6)Fig.3　Effect of glycyrrhizic acid on the expression of cleaved caspase 3, 9 proteins in the hypocampal tissues of epileptic rats

2.5　甘草酸对癫痫大鼠海马组织中Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

与正常对照组比较，癫痫组Bax表达量上调，Bcl-2表达量下调(P< 0.01)；与癫痫组比较，甘草酸组Bax表达量下调，Bcl-2表达量上调(P< 0.01)。(图4)

图4　甘草酸对癫痫大鼠海马组织中Bax及Bcl-2蛋白表达的影响(n=6)Fig.4　Effect of glycyrrhizic acid on the expression of Bax and Bcl-2 proteins in the hypocampal tissues of epileptic rats

2.6　甘草酸对癫痫大鼠海马组织中CytC/Apaf-1信号通路相关蛋白表达的影响

与正常对照组比较，癫痫组海马神经元线粒体中CytC表达量下调(P<0.01)，细胞质中CytC、Apaf-1表达量上调(P< 0.01)；与癫痫组比较，甘草酸组海马神经元线粒体中CytC表达量上调(P< 0.01)，细胞质中CytC、Apaf-1表达量下调(P< 0.01)。(图5)

3　讨论

癫痫是由多种因素导致大脑神经元过度放电从而引起的一种刻板性、反复性、发作性的中枢系统疾病，是仅次于脑血管病的第二大中枢神经系统性疾病，并且发病率逐年上升。有研究显示氯化锂-匹鲁卡品所构建的癫痫动物模型与人类高度相似，具有类似的神经元细胞凋亡、损伤、丢失，胶质细胞的激活、增生等病理改变[9-10]，因此本研究参考相关文献使用33只SD大鼠腹腔注射氯化锂-匹鲁卡品点燃制作癫痫模型，结果发现癫痫发作4级以上的大鼠有28只，3级以下的有3只，2只在造模过程中死亡，造模成功率为84.8%。同时Nissl法及TUNEL法显示癫痫动物海马神经元数量减少，凋亡增加，从而说明大鼠癫痫模型构建成功。

研究表明癫痫能够造成动物脑部神经细胞数目减少、神经元凋亡、神经功能受损、学习及记忆等认知功能减退[9-10]。因此，本研究首先通过Nissl及TUNEL实验检测甘草酸对癫痫大鼠海马损伤及凋亡的影响。实验结果表明甘草酸能够显著的增加癫痫大鼠海马神经元数量，减少海马神经元凋亡，与甘草酸减轻帕金森、阿尔兹海默病引起的大鼠脑神经元凋亡结果类似[6-7]，说明甘草酸对癫痫引起的大鼠海马神经元损伤具有一定的抑制作用。

线粒体为细胞代谢提供充足能量，而癫痫能够引起神经细胞线粒体功能障碍，从而导致线粒体膜电位降低、细胞膜通透性增加，最终使神经元细胞凋亡[11-13]。当线粒体受到外界凋亡信号刺激后，促使线粒体中CytC释放，CytC进入细胞质中与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)形成复合物后，激活caspase 9，caspase 9通过级联放大反应，将凋亡信号传递给caspase 3，最终导致DNA断裂，细胞凋亡[14]。另外细胞的凋亡又受凋亡蛋白调控，Bcl-2家族是其中一种，抑制凋亡蛋白Bcl-2与凋亡蛋白Bax形成复合物，阻断凋亡信号传递，最后使细胞存活。研究显示甘草酸对细胞线粒体途径具有一定的调控作用[15]。因此本研究进一步的探讨了甘草酸对线粒体途径相关蛋白表达的影响，结果表明甘草酸能显著提高线粒体膜电位，降低caspase 3、9活性，上调Bcl-2及线粒体中CytC表达，下调Bax、细胞质中CytC及Apaf-1表达，最终抑制癫痫引起的大鼠海马神经元凋亡，为甘草酸在癫痫的临床应用提供了理论依据。