Galectin家族成员对HIV-1感染巨噬细胞凋亡的影响

王永芳，彭卓颖，李　想，丛　喆，薛　婧，魏　强

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室，北京　100021)

HIV-1感染机体后，破坏机体的免疫系统，使感染者丧失抵抗力进而引发全身疾病，最终发展成为艾滋病。虽然抗逆转录病毒疗法的应用显著改善了艾滋病患者的生存质量，但仍无法彻底治愈艾滋病[1]。单核-巨噬细胞是HIV-1重要的潜伏感染靶细胞[2-3]，因此诱导单核-巨噬细胞凋亡对治疗艾滋病具有重要意义。半乳糖凝集素家族成员(galectins)可以调节细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用、细胞黏附、细胞信号传导等多种生物学过程，并且某些成员与细胞凋亡密切相关。例如galectin-2、galectin-4诱导外周血单核细胞凋亡[4]；上皮细胞的研究表明细胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)通过COX-2调节galectin-7表达进而诱导caspase-3、caspase-9活化，促凋亡蛋白Bax、Bcl-xs表达量升高从而诱导细胞凋亡[5]；Galectin-8诱导1299 cells非小细胞肺癌细胞凋亡[6]；Galectin-9诱导T细胞、B细胞、单核细胞凋亡等[7]。我们前期研究发现galectin-3通过Endo G的核转移诱导HIV-1感染的单核-巨噬细胞凋亡[8]，但galectin家族其他成员对HIV-1感染的巨噬细胞的凋亡影响尚不明确。鉴于文献报道galectin家族成员中galectin-2、galectin-4、galectin-7、galectin-8、galectin-9与细胞凋亡相关，本文主要研究了它们对HIV-1感染巨噬细胞凋亡的影响。

1　材料和方法

1.1　细胞

人单核细胞系THP-1来自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；人胚肾传代细胞系293T来自中国医学科学院医学实验动物研究所。

1.2　主要试剂及仪器

RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰酶均购自Gibco公司；DMEM完全培养基购自HyClone公司；Annexin V/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司；佛波醇肉豆蔻酸酯 (PMA)购自Sigma公司；HIV-1(Clone:11739R5 tropic)全长质粒为 NIH惠赠；重组蛋白galectin-2、galectin-4、galectin-7、galectin-8、galectin-9均购自R&D公司；polybrene购自Millipore公司；流式细胞仪Accuri C6购自BD公司。

1.3　实验方法

1.3.1细胞培养

THP-1是悬浮细胞，培养基为包含10%胎牛血清和2%双抗的RPMI-1640完全培养基，将细胞浓度调整到每毫升5×105～1×106个，在37℃、5% CO2孵箱中培养。

1.3.2不同浓度galectins诱导THP-1细胞凋亡检测及分组

取旺盛生长期的THP-1细胞每孔5 ×105个细胞在96孔板中培养，实验组为每孔添加终浓度为1.5、3、5、10 μmol/L的galectin-2；1.5、3、5、10 μmol/L的galectin-4；1.5、3、5、7.5、10 μmol/L的galectin-7；0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L的galectin-8；0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L的galectin-9。对照组为不添加galectin家族成员。在37℃、5% CO2孵箱中孵育细胞6 h，然后获取细胞用annexin V/7-AAD染色，上机检测细胞凋亡情况。

1.3.3流式细胞术检测细胞凋亡

在96孔板中加入200 μL 0.2% β-乳糖，显微镜下观察待细胞解聚后吸入流式管中，加入2 mL预冷的PBS将细胞洗一遍；加入2 mL预冷的1×annexin V binding buffer将细胞洗两遍；加入100 μL预冷的1×annexin V binding buffer，然后加入3 μL annexin V和3 μL 7-AAD并轻轻混匀后置于室温下避光孵育15 min；加入300 μL预冷的1×annexin V binding buffer，以200目筛网过滤，在1 h内上机检测。

1.3.4PMA刺激单核细胞分化为巨噬细胞

取旺盛生长期的THP-1细胞调整细胞浓度为每毫升1×106个，接种于6 cm无菌细胞培养皿中。并在其中加入佛波醇肉豆蔻酸酯 (phorbol myristate acetate, PMA)调整其终浓度为50 ng/mL，培养24～48 h后即可分化为巨噬细胞。

1.3.5制备HIV-1病毒并用其感染巨噬细胞

将NIH惠赠的HIV-1全长质粒(Clone: 11739 R5 tropic)用阳离子脂质体的方法转染进入293T细胞，转染后12 h后更换新鲜的培养基，转染后48 h获取HIV-1病毒悬液。之后以HIV-1病毒悬液∶细胞培养基=1∶2的比例培养细胞4～5 d后获取细胞。

细胞转染前24 h需要接种适量293T在6 cm无菌细胞培养皿中，使其转染时细胞密度在80%～90%之间为宜；细胞转染前1 h需要更换新鲜的培养基，在37℃、5% CO2孵箱中培养；将10 μg HIV-1质粒，用稀释液(0.9% NaCl)稀释到总体积200 μL，然后轻轻混匀并置于室温放置；将4 μL VigoFect，用稀释液(0.9% NaCl)稀释到总体积200 μL，然后轻轻混匀并置于室温放置5 min；将稀释好的VigoFect溶液逐滴慢慢加入到稀释好的HIV-1质粒溶液中，然后轻轻混匀并将所得到的转染工作液置于室温放置15 min；将所得到的转染工作液逐滴慢慢加入到4 mL 293T培养基中，然后轻轻混匀并在37℃、5% CO2孵箱中培养；转染后12 h更换新鲜的培养基；转染后48 h获取病毒悬液，2000 r/min离心10 min后收集上清并分装冻存；HIV-1感染巨噬细胞将HIV-1病毒悬液：细胞培养基=1∶2的比例培养巨噬细胞并加入助转剂polybrene使其终浓度为10 μg/mL，12 h后更换新鲜培养基，更换培养基时用PBS清洗细胞2次，24 h后二次感染细胞，36 h后更换新鲜培养基，在37℃、5% CO2孵箱中培养4～5 d。

1.3.6流式细胞术检测galectin家族成员诱导巨噬细胞、HIV-1感染的巨噬细胞凋亡情况

取巨噬细胞(THP-1-Mφ)、HIV-1感染的巨噬细胞(HIV-1-THP-1-Mφ)每孔5 ×105个细胞在96孔板中培养，实验组为每孔分别添加5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin-4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8、1 μmol/L galectin-9，对照组为不添加galectin家族成员。在37℃、5% CO2孵箱中孵育细胞6 h，然后获取细胞用annexin V/7-AAD染色，上机检测细胞凋亡情况。

1.4　统计学方法

2　结果

2.1　不同浓度Galectin-2对THP-1细胞凋亡的影响

结果显示，对照组细胞凋亡率为(1.84±0.35)%，1.5、3、5、10 μmol/L galectin-2诱导THP-1细胞凋亡率分别为(2.85±0.38)%、(8.70±0.61)%、(17.83±0.82)%、(87.60±0.46)%。(图1)

2.2　不同浓度Galectin-4对THP-1细胞凋亡的影响

结果显示，对照组细胞凋亡率为(1.97±0.24)%，1.5、3、5、10 μmol/L galectin- 4诱导THP-1细胞凋亡率分别为(4.13±0.52)%、(9.26±1.66)%、(75.97±0.98)%、(97.63±0.55)%。(图2)

2.3　不同浓度Galectin-7对THP-1细胞凋亡的影响

结果显示，对照组细胞凋亡率为(4.09±0.47)%，1.5、3、5、7.5、10 μmol/L galectin-7诱导THP-1细胞凋亡率分别为(3.47±0.55)%、(3.76±0.63)%、(4.59±0.78)%、(18.56±0.64)%、(98.08±1.23)%。(图3)

图1　不同浓度的galectin-2诱导THP-1细胞凋亡Fig.1　Apoptosis of THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-2

图2　不同浓度的galectin-4诱导THP-1细胞凋亡Fig.2　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-4

图3　不同浓度的galectin-7诱导THP-1细胞凋亡Fig.3　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-7

2.4　不同浓度Galectin-8对THP-1细胞凋亡的影响

结果显示，对照组细胞凋亡率为(1.73±0.21)%，0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L galectin-8诱导THP-1细胞凋亡率分别为(1.74±0.20)%、(2.00±0.06)%、(2.39±0.19)%、(4.57±0.21)%、(27.61±1.30)%、(76.15±2.36)%。(图4)

图4　不同浓度的galectin-8诱导THP-1细胞凋亡Fig.4　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-8

2.5　不同浓度Galectin-9对THP-1细胞凋亡的影响

结果显示，对照组细胞凋亡率为(3.84±0.35)%，0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L galectin-9诱导THP-1细胞凋亡率分别为(3.90±0.24)%、(8.50±0.16)%、(19.61±0.57)%、(90.43±2.98)%、(98.20±0.31)%、(95.20±0.89)%。(图5)

图5　不同浓度的galectin-9诱导THP-1细胞凋亡Fig.5　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-9

2.6　流式细胞术检测Galectin家族成员诱导巨噬细胞凋亡情况

鉴于上述实验结果，当galectins浓度太高时，细胞几乎会发生全部凋亡，不利于后续比较未感染组与HIV-1感染组在处理前后细胞凋亡的变化。本文选用5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8和1 μmol/L galectin-9作为适宜浓度分别处理未感染与HIV-1感染的巨噬细胞并检测其凋亡情况。

针对未感染的单核-巨噬细胞，结果表明，未添加galectin家族成员的巨噬细胞(THP-1-Mφ)凋亡率为(4.39±0.74)%，5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8、1 μmol/L galectin-9分别诱导巨噬细胞(THP-1-Mφ)的凋亡率为(4.78±0.41)%、(7.21±1.46)%、(3.78±1.03)%、(5.88±2.08)%、(8.10±4.13)%。统计结果显示，与未添加galectin家族成员的巨噬细胞相比，5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8及1 μmol/L galectin-9均对巨噬细胞(THP-1-Mφ)的凋亡作用无显著性差异(P> 0.05)。(图6)

图6　Galectin-2、galectin- 4、galectin-7、galectin-8、galectin-9诱导巨噬细胞(THP-1-Mφ)凋亡Fig.6　Apoptosis in macrophages induced by galectin-2, galectin- 4, galectin-7, galectin-8 and galectin-9

2.7　流式细胞术检测Galectin家族成员诱导HIV-1感染的巨噬细胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡情况

针对HIV-1感染的单核-巨噬细胞，结果表明，未添加galectin家族成员的HIV-1感染的巨噬细胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡率为(12.69±1.16)%；5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8、1 μmol/L galectin-9诱导HIV-1感染的巨噬细胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡率分别为(11.69±0.90)%、(17.45±1.30)%、(32.01±1.30)%、(15.77±1.21)%、(19.27±2.13)%。统计结果显示，与未添加galectin家族成员的HIV-1感染的巨噬细胞相比，5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、3 μmol/L galectin-8及1 μmol/L galectin-9均对HIV-1感染的巨噬细胞(HIV-1-THP-1-Mφ)的凋亡作用无显著性差异(P> 0.05)；7.5 μmol/L galectin-7诱导HIV-1感染的巨噬细胞(HIV-1-THP-1-Mφ)发生大量凋亡，与对照组相比，差异有显著性(P< 0.001)。(图7)

注：与对照组相比，***P < 0.001。图7　Galectin-2、galectin-4、galectin-7、galectin-8、galectin-9诱导HIV-1感染的巨噬细胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡Note. Compared with the control group,***P < 0.001.Fig.7　Apoptosis in HIV-l-infected macrophages induced by galectin-2, galectin-4, galectin-7, galectin-8 and galectin-9

3　讨论

病毒储存库的存在是艾滋病难以根治的最大难点，单核-巨噬细胞是HIV-1感染的一类重要的病毒储存库。我们前期的研究发现galectin-3通过Endo G的核转移能够诱导HIV-1感染的单核-巨噬细胞发生凋亡[8]。本研究结果发现7.5 μmol/L galectin-7能够诱导HIV-1感染的巨噬细胞发生大量凋亡，且不会诱导未经HIV-1感染的单核-巨噬细胞发生凋亡。在Galectin家族成员诱导HIV-1感染的单核-巨噬细胞凋亡的研究中，我们发现只有galectin-3和galectin-7对于未感染和HIV-1感染的单核-巨噬细胞凋亡存在病毒感染的特异性，而galectin-2、galectin-4、galectin-8和galectin-9并没有对HIV-1感染发生特异作用。这一结果提示了galectin-3和galectin-7能够识别HIV-1感染后细胞表面的某些聚糖分子或者识别发生糖基化改变的表面受体，致使其可以区分识别未感染和HIV-1感染的单核-巨噬细胞，进而启动病毒感染细胞下游分子的凋亡信号通路，最终能够诱导HIV-1感染的单核-巨噬细胞发生凋亡。

我们的结果发现高浓度的galectins可能由于毒性较大会造成几乎全部细胞发生凋亡，同时考虑到大剂量galectins的使用浓度不利于临床应用，因此本文中galectins的适宜浓度为能使细胞发生明显凋亡的最低浓度。研究结果显示7.5 μmol/L galectin-7对HIV-1感染的单核-巨噬细胞具有凋亡诱导的特异性作用，但其若实现临床应用，仍存在剂量过大等问题，对于galectin-7的最佳临床应用剂量和安全性仍有待大量实验的检验。此外，对于HIV-1感染的单核-巨噬细胞，galectin-7识别的病毒感染特异性作用机制以及启动的下游凋亡信号通路研究目前正在进行中。综上所述，galectin-7对HIV-1感染的单核-巨噬细胞凋亡具有重要作用，为清除HIV-1感染的单核-巨噬细胞提供了新思路，有助于清除部分病毒储存库，从而为实现艾滋病的功能性治愈奠定理论基础。