乌梅喷雾剂与灌胃剂对大鼠放射性口干症治疗比较研究

叶景云，陈佩仪

(广州中医药大学，广州　510006)

在我国，头颈部肿瘤是华南地区的高发病，如鼻咽癌、喉癌、甲状腺肿瘤等，尤其是鼻咽癌，在广东省的发病率更高，而甲状腺肿瘤的发病趋势也在明显上升[1-4]。放射治疗逐渐成为鼻咽癌等头颈部肿瘤主要及重要的治疗方法，且早期头颈部肿瘤放疗治愈率高达90%[5]。但在放射治疗过程中，由于患者主要的涎腺组织包被在放射治疗野内，造成了唾液腺不可避免的损伤，唾液腺功能损伤将导致唾液分泌减少，从而促使口腔干燥、口腔黏膜炎及口腔溃疡等继发。从中医基础理论分析，肿瘤患者本身肝肾亏虚，而放射线属火毒之邪，最易耗气伤阴，故放射性口干症是放疗后最常见的并发症之一。基于“酸甘化阴”理论的乌梅合剂是以乌梅与甘草配伍的针对口干症而研制的一种新型制剂，目前已通过含漱液及喷雾剂作用于头颈部肿瘤放疗后口干及胃肠道术后口干病人的临床试验[6-8]，亦在成功建立放射性口干症大鼠模型后以不同浓度乌梅喷雾剂研究其对颌下腺损伤细胞形态的修复作用。以往对乌梅甘草复方合剂以何种方式用药才能较好的发挥其缓解口干的作用鲜有研究，本文分别用喷雾与灌胃两种给药方式，比较研究乌梅合剂对放射性口干的治疗作用作用，现报道如下。

1　材料和方法

1.1　实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠112只，6～7周，体重(222.7±18.5)g，由广州中医药大学动物实验中心提供[SCXK(粤) 2013-0034]，动物饲养及实验操作与广州中医药大学实验动物中心[SYXK(粤)2008-0085]，本实验符合伦理要求，通过广州中医药大学动物实验伦理审查批复。

1.2　主要试剂及仪器

乌梅喷雾剂中的乌梅与甘草颗粒剂由广东省一方制药有限公司生产(批号：6062401)，乌梅颗粒剂(每包0.7 g，相当于饮片每包5 g)与甘草颗粒剂(每包0.17 g，相当饮片每包1 g)；匹罗卡品(大连美仑)；水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)；钾(K)测试盒(南京建成)；钠(Na)测试盒(南京建成)；a-淀粉酶(AMS)测试盒(南京建成)。

美国医用Varian 23EX直线加速器，能量为9 MV，剂量率为3 Gy/min，由广东省中医院大学城分院放疗科技术提供；分光光度计检测，型号UV1100II(上海天美公司)；微量有机除热源型超纯水，型号WP-UP-UV-20(四川沃特尔公司)；切片机：Leica-RM2015；显微镜：奥特 BK-M500 型数码显微镜；酶标仪：赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；2 mL Eppendorf(EP)管。

1.3　实验方法

1.3.1造模与分组

112只Wistar大鼠，其中照射组84只，正常组28只。适应环境3 d，禁饮禁食12 h后，照射组84只Wistar大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，仰卧使唾液腺区暴露在照射野(1.5×1.5 cm2)，其他部位用2 cm 厚铅皮遮挡，避免其它部位受到射线影响，麻醉后使用直线加速器一次性照射18 Gy(射线类型：电子线，能量为9 MV，剂量率为3 Gy/min)，分批进行照射，每次6只。所有大鼠照射时间均在上午 8:00～10:00进行，正常组28只不放射，放射性口干动物模型的方法参照本研究团队已成功建模的方法[9]。喷雾给药组分组：乌梅组(A1)、匹罗卡品(阳性对照)组(B1)、模型组(C1)、正常组(D1)，每组各14只。灌胃给药组分组：乌梅组(A2)、匹罗卡品(阳性对照)组(B2)、模型组(C2)、正常组(D2)，每组各14只。

1.3.2喷雾剂与灌胃剂的制备

实验组喷雾剂的制备，乌梅颗粒剂与甘草颗粒剂按饮片高浓度比例60∶12 g，用20～25 mL双蒸水溶解，倒入喷雾小瓶，配制成3倍(高)浓度的乌梅喷雾剂。实验组灌胃剂使用相同乌梅及甘草颗粒剂，按饮片高浓度比例60∶12 g，用200 mL双蒸水稀释配置，每次用前新鲜配制。

1.3.3给药方法

每组均一天三次正常饮食。喷雾组在放射性损伤后每天给药三次，一人抓取老鼠，一人喷雾给药，每次喷一下(0.1 mL)。实验灌胃组每天给药三次，每次每只2 mL。给药均在餐前(8:00、12:00、18:00)进行。给药直至7 d及14 d实验结束后统一在上午8:00～10:00取材，每组两个时间点各取7只大鼠。

1.3.4大鼠唾液样本的采集

腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，颈部皮下注射毛果芸香碱(2 mg/kg)刺激唾液分泌，棉球擦尽大鼠口腔唾液，用移液枪收集口腔内唾液，将唾液收集在已称重的 2 mL离心管内，收集 20 min,收集过程中离心管置于碎冰中，避免唾液成份变性[10]。

1.3.5唾液样本的保存及检测

将收集的唾液样本于4℃下，10 000 r/min，离心5 min，将上清转移至另一干净EP管，-20℃保存，待测活性。Na+、K+用去离子水稀释10倍、淀粉酶用生理盐水稀释200倍，均使用分光光度计检测。Na+、K+采用比浊法，又称浊度测定法，为测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，是一种光散射测量技术。唾液淀粉酶采用碘-淀粉比色法，是利用淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖等，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未分解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅算出水解的淀粉量，从而计算淀粉酶的活力。

1.3.6腺体指数及颌下腺组织形态学观察评价(HE染色)

实验结束处死小鼠后，立即摘取双侧颌下腺，进行称重，计算腺体指数(颌下腺指数(mg/g)= 颌下腺质量(mg)/ 小鼠体质量(g)，腺体指数反映腺体变化，指数降低提示腺体萎缩及退行性病变[11])。腺体置于4%多聚甲醛中浸泡固定3 h，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片机切片5 μm，苏木精-伊红染色，光镜下观察观察组织形态。HE 染色病理结果由广州中医药大学病理实验室协助测定。

1.4　统计学方法

2　结果

2.1　体重

由表1可见，各组大鼠体重差异无显著性(P> 0.05)。造模后除正常组外，模型组及给药组均有大鼠出现多饮少食、尿黄、张力减弱、精神疲惫、颈部毛发脱落或者枯燥等症状，模型组及灌胃组少数大鼠出现肠胀气的现象。

2.2　唾液量及腺体指数

如表2所示：在放射后第7天，喷雾组内正常组(D1)与模型组(C1)比较，正常组唾液量明显多于模型组，差异有显著性(P< 0.01)，灌胃组内正常组(D2)唾液量多于模型组(C2)，差异有显著性(P< 0.01)，以此可判断大鼠放射性口干模型成立；在放射给药后第7天，喷雾组内乌梅组(A1)唾液量及腺体指数与模型组(C1)及匹罗卡品组(B1)比较，差异均有显著性(P< 0.05)，灌胃组内匹罗卡品组(B2)唾液量与模型组(C2)对照差异有显著性，而腺体指数无明显变化。在放射后给药第14天，喷雾组内乌梅组(A1)唾液量及腺体指数与模型组(C1)比较差异均有显著性(P< 0.05)。第7及14天，乌梅喷雾组(A1)唾液量与颌下腺指数均较乌梅灌胃组(A2)高(P< 0.01或P< 0.05)。

2.3　成份分析

如表3所示，放射性治疗后14 d，乌梅喷雾组与乌梅灌胃组比较钠离子比较，淀粉酶的差异有显著性(P< 0.01)。喷雾组内，乌梅喷雾组与模型组比较，Na+、淀粉酶差异有显著性(P< 0.05)，相反在灌胃组内差异无显著性(P>0.05)。

表1　各组基线资料的比较

表2　两种方式对放射性口干症大鼠唾液量及腺体指数的影响

注：与C1比，aP< 0.05，aaP< 0.01；与C2比，bP< 0.05，bbP< 0.01；与B1比，cP< 0.05；与A2比，dP< 0.05，ddP< 0.01。

Note. Compared with the C1 group,aP< 0.05，aaP< 0.01. Compared with the C2 group，bP< 0.05，bbP< 0.01. Compared with the B1 group，cP< 0.05. Compared with the A2 group，dP< 0.05，ddP< 0.01.

表3　两种方式14 d后对放射性唾液腺损伤大鼠唾液成份的影响

注：与C1比较，*P< 0.05；与A2比较，#P< 0.01。

Note. Compared with the C1 group，*P< 0.05. Compared with the A2 group，#P< 0.01.

2.4　各组颌下腺组织形态学观察

颌下腺病理变化(HE×200)显示，放射后7 d，喷雾组及灌胃组内正常组腺泡细胞完好，大小均一，导管结构正常而未见明显病理变化；模型组放射后7 d颌下腺腺泡大小不等，间质水肿、有淋巴细胞炎性浸润，腺泡细胞轻微萎缩，放射后14 d局部腺泡呈空泡变性及坏死。放射后第7天，乌梅喷雾组与乌梅灌胃组相比，颌下腺腺小叶间隙较小，腺体周围炎性细胞浸润程度较低，反射后第14天，乌梅喷雾组少量散在单个淋巴细胞浸润，腺泡大小不一，偶见少量腺泡及导管结构破坏，腺体核固缩数量减少，未能恢复至正常组水平。而乌梅灌胃组第7天及14天均显示部分腺体细胞持续发生空泡性坏死，腺体细胞核固缩明显。

注：A: 乌梅组 B: 匹罗卡品组 C: 模型组 D：正常组。图1　放射后第7天颌下腺病理变化(×200)Note. A: Dark plum group. B: Pilocarpine (positive control) group. C: Model group. D: Normal group.Fig.1　Morphological changes of the submandibular glands of rats at 7th day after irradiation

注：A: 乌梅组 B: 匹罗卡品组 C: 模型组 D：正常组。图2　放射后第14天颌下腺病理变化(×200)Note. A: Dark plum group. B: Pilocarpine (positive control) group. C: Model group. D: Normal group.Fig.2　The morphological changes of submandibular gland of the rats at 14 days after irradiation

3　讨论

本研究利用乌梅甘草合剂分别经灌胃和喷雾两种方式，对比不同给药途径对放射性口干症Wistar大鼠的唾液腺的影响作用。结果显示，乌梅甘草合剂通过口腔喷雾给药，可有效降低放射性损伤唾液腺的萎缩程度及腺体周围炎症细胞的浸润，且通过7 d、14 d的观察，口腔喷雾给药可持续刺激作用于大鼠的唾液腺，并进一步降低其腺泡及导管结构被破坏的程度，这与陈倩怡等[15]放射后高浓度乌梅喷雾剂组的颌下腺腺小叶细胞萎缩程度降低，腺体周围炎症细胞浸润减少的研究结果相符，提示在放射性口干症方面，相对于灌胃给药，口腔喷雾给药可促进大鼠唾液腺细胞形态的恢复，但其具体的作用机制仍需进一步的研究。

放射性口干症大鼠的唾液腺分泌能力受损，唾液量下降。结果显示，喷雾组及灌胃组均能提高大鼠唾液量的分泌，且喷雾组效果好于灌胃组，且根据14 d的唾液量观察，乌梅喷雾组的唾液量明显高于模型组，而灌胃组则无明显变化，这与谢秀荣等[6]临床试验中乌梅喷雾剂可有效缓解头颈部肿瘤患者放疗后第2周的口干症状相符。两组组内的模型组大鼠唾液量均呈进行性下降的趋势，这与Vissink等[16]放射后腺体唾液流率明显下降的研究结果相符，但目前尚未有关于乌梅合剂在喷雾及灌胃途径方面对大鼠唾液腺分泌的影响作用方面的文献。

放射性口干症大鼠的唾液成分也因不同的给药途径而改变。结果显示乌梅喷雾剂对放射性唾液腺损伤大鼠早、中期唾液Na+、K+及唾液淀粉酶成分有一定的影响，喷雾途径可增加钠钾的比值，同时增加唾液淀粉酶的活性，后期研究中可延长乌梅喷雾及灌胃途径对大鼠唾液成分影响作用的观察周期，从而进一步分析不同途径对唾液成分作用的有效时间。

相比于乌梅灌胃剂，乌梅喷雾剂药物剂量低，缓解放疗后口干效果明显，喷雾剂型携带方便，居家易行，但其作用途径的机制研究不足，难以在临床上扩大使用。本研究结果提示乌梅喷雾剂可促进大鼠的唾液分泌，改变唾液成分，降低唾液腺细胞的病理损伤程度，但自噬机制及水通道蛋白是腺泡细胞水分泌的关键[17]，乌梅甘草合剂的给药途径区别研究还需进一步探索自噬及水通道蛋白作用的机制，亟待加强基础研究，为乌梅甘草合剂在临床上的使用剂型提供更充分的依据。

参考文献：