TGF-β1对M2型巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞增殖的影响

谢　瑜，黎承平，武　坤，谭　琳

(1.昆明医科大学第一附属医院血液内科，昆明　650032； 2.昆明医科大学第一附属医院检验科，昆明　650032)

淋巴瘤是一种发生在造血系统的血液肿瘤，在全部的恶性肿瘤中约占1.13%，肿瘤的发生除了与肿瘤细胞的生长有关以外，还与微环境有关，微环境包括基质细胞、白细胞等，其中巨噬细胞是白细胞的重要组成部分[1-2]。巨噬细胞有M1和M2型，其中M2型巨噬细胞是目前公认的能够诱导淋巴瘤细胞增殖、侵袭、迁移的巨噬细胞[3-4]。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是具有多种功能的生长因子，人体内的几乎所有细胞都可以合成TGF-β1，其可以对细胞免疫功能、增殖等进行调控，并且与肿瘤的发生有关[5-6]。目前的研究显示，TGF-β1对不同的肿瘤细胞的生长作用不同，并且TGF-β1在癌症早期可以发挥抗肿瘤作用，而在癌症的中、后期发挥促进肿瘤发展的作用[7]。研究表明，TGF-β1能够抑制淋巴瘤细胞增殖[8]。本实验拟通过探讨TGF-β1对巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响，为以后研究肿瘤的发病机制和寻找有效的治疗方法提供基础。

1　材料和方法

1.1　材料

人单核细胞THP-1和淋巴瘤细胞Jiyoye均购自于中科院细胞库。

1.2　主要试剂及仪器

二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天研究所；RPMI1640购自美国Sigma；蛋白提取试剂盒购自德国Qiagen；基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotease 9, MMP-9)抗体、增殖细胞核抗原(PCNA)抗体、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotease 2, MMP-2)抗体、细胞核增殖抗原(Ki- 67)抗体购自于美国CTS；辣根过氧化物标记的IgG购自于碧云天；胎牛血清购自于杭州四季青；β肌动蛋白(β-actin)抗体购自于美国Abcam；TGF-β1购自美国Biovision；3K18低温高速离心机购自美国Sigma；MK3酶标仪、371型CO2培养箱购自美国Thermo。

1.3　实验方法

1.3.1MTT测定TGF-β1对淋巴瘤增殖影响

淋巴瘤细胞Jiyoye培养于含有10%胎牛血清的RPMI 1640中，将细胞种植于96孔板中(种植密度为每孔4000个细胞)，并且在细胞中添加TGF-β1，使其最终浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.6 ng/mL。将细胞放在37℃，5% CO2培养箱培养48 h。培养结束后，在每孔中依次添加10 μL的MTT，再继续孵育4 h。把孔中的上清液吸除掉，再添加150 μL的DMSO。10 min以后，酶标仪测定540 nm各组的OD值。分组情况如表1。

表1　各组分组处理情况

1.3.2巨噬细胞诱导分化及分组处理

THP-1细胞培养于10%胎牛血清的RPMI 1640中，在实验前用M-CSF将巨噬细胞诱导分化为M2型巨噬细胞。实验分为Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1共4组细胞。Control为常规培养的Jiyoye细胞；TGF-β1为用0.4 ng/mL的TGF-β1培养的Jiyoye细胞；M2为用M2型巨噬细胞培养液上清培养的Jiyoye细胞；M2+TGF-β1为用M2型巨噬细胞培养液上清培养的Jiyoye细胞，同时在培养液中添加0.4 ng/mL的TGF-β1。Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1细胞按照上述方法分组处理以后，MTT法测定48 h的增殖情况。诱导分化步骤如下[9]：取约7×106个细胞接种到T25细胞瓶内，0 d时在细胞培养液中添加20 ng/mL的M-CSF，在第5天时用含有20 ng/mL M-CSF、20 ng/mL IL-4、20 ng/mL IL-13、20 ng/mL IL-6的培养液诱导分化。诱导分化共9 d。

1.3.3Transwell小室测定侵袭和迁移

Jiyoye细胞用不含血清的培养液悬浮，接种于Transwell小室中，按照Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1分组处理，另外在小室的下室中添加含血清的培养液。分别用基质胶湿化(侵袭)和无基质胶湿化(迁移)的孔径为8 μm的Transwell小室按照上述方法处理，培养48 h以后，把上室取出，取棉签把上室中没有穿膜的细胞擦掉，然后置于甲醇溶液中固定10 min，再用0.1%结晶紫染色以后，放在倒置显微镜下对穿膜的细胞进行统计，每组样品随机选5个视野。

1.3.4Western blot分析MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白表达

Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1细胞按照上述方法分组处理培养48 h以后，提取细胞总蛋白，用BCA法对蛋白定量。分别配制10%分离胶、5%浓缩胶进行电泳。按照每孔添加50 μg样品进行变性处理。80 V的电压条件下电泳30 min；120 V的电压条件下电泳直到染料进入到凝胶底部。在200 mA恒流条件下把蛋白转移到硝酸纤维素膜上，转膜时间约为60 min。取膜，用5%脱脂奶粉于室温环境封闭1.5 h，在1∶600、1∶600、1∶800、1∶800稀释的MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67一抗中4℃孵育12 h，再把膜放在1∶3000稀释的二抗中室温孵育2 h。用ECL发光以后，Image J测定条带灰度值，以β-actin为内参。

1.4　统计学方法

2　结果

2.1　TGF-β1对淋巴瘤细胞增殖的影响

结果见图1中所示，用0、0.2、0.4、0.8、1.6 ng/mL浓度的TGF-β1处理后的细胞OD值分别为：0.85±0.06、0.64±0.05、0.47±0.03、0.35±0.05、0.26±0.04。0、0.2、0.4、0.8、1.6 ng/mL浓度的TGF-β1处理后的细胞OD值比较，经单因素方差分析，差异具有显著性(P< 0.001)，0.2、0.4、0.8、1.6 ng/mL浓度的TGF-β1作用后的淋巴瘤细胞OD值明显低于0 ng/mL(P< 0.05)。0.4、0.8、1.6 ng/mL浓度的TGF-β1作用后的淋巴瘤细胞OD值明显低于0.2 ng/mL(P< 0.05)。0.8、1.6 ng/mL浓度的TGF-β1作用后的淋巴瘤细胞OD值明显低于0.4 ng/mL(P< 0.05)。1.6 ng/mL浓度的TGF-β1作用后的淋巴瘤细胞OD值明显低于0.8 ng/mL(P< 0.05)。TGF-β1可以抑制淋巴瘤细胞的增殖。TGF-β1对淋巴瘤细胞半数抑制浓度约为0.4 ng/mL，所以采用0.4 ng/mL的TGF-β1作后续实验。

注：与0 ng/mL相比，aP< 0.05；与0.2 ng/mL相比，bP< 0.05；与0.4 ng/mL相比，cP< 0.05；与0.8 ng/mL相比，dP< 0.05。图1　TGF-β1对淋巴瘤细胞增殖的影响Note.Compared with 0 ng/mL treatment，aP< 0.05. Compared with 0.2 ng/mL treatment，bP< 0.05. Compared with 0.4 ng/mL treatment，cP< 0.05. Compared with 0.8 ng/mL treatment，dP< 0.05.Fig.1　Effect of TGF-β1 on the proliferation of lymphoma cells

2.2　TGF-β1对巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞增殖影响

结果见图2中所示，Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1细胞OD值分别为：0.78±0.09、0.42±0.05、1.16±0.13、0.86±0.08。4组细胞OD值比较差异有显著性(P< 0.001)，TGF-β1细胞OD值明显低于Control(P< 0.05)。M2细胞明显高于Control(P< 0.05)。M2+TGF-β1细胞OD值明显高于TGF-β1，并且低于M2(P< 0.05)。M2型巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞增殖，TGF-β1可以减弱M2型巨噬细胞对淋巴瘤细胞增殖的诱导作用。

注：与Control相比，aP< 0.05；与TGF-β1相比，bP< 0.05；与M2相比，cP< 0.05。图2　TGF-β1对巨噬细胞诱导的淋巴瘤细胞增殖影响Note.Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the TGF-β1-treated group,bP< 0.05. Compared with the M2-treated group，cP< 0.05.Fig.2　Effect of TGF-β1 on the proliferation of lymphoma cells induced by macrophages

2.3　TGF-β1对巨噬细胞诱导的淋巴瘤细胞侵袭影响

注：(A)Transwell小室测定细胞侵袭结果；(B)各组细胞侵袭数目；与Control相比，aP< 0.05；与TGF-β1相比，bP< 0.05；与M2相比，cP< 0.05。图3　TGF-β1对巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞侵袭影响Note.(A)Transwell chamber for measuring cell migration.(B)Number of migrated cells in each group. Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the TGF-β1-treatment group,bP< 0.05. Compared with the M2-treated group,cP< 0.05.Fig.3　Effect of TGF-β1 on the invasion of macrophage-induced lymphoma cells

图3所示，Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1细胞侵袭细胞数目分别为：147.28±13.92、110.35±10.64、213.92±16.79、158.67±13.26。4组细胞侵袭细胞数目整体比较差异有显著性(P< 0.001)，TGF-β1侵袭细胞数目明显低于Control(P< 0.05)。M2侵袭细胞数目明显高于Control(P< 0.05)。M2+TGF-β1侵袭细胞数目明显高于TGF-β1，并且低于M2(P< 0.05)。M2型巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞侵袭，TGF-β1可以减弱M2型巨噬细胞对淋巴瘤细胞侵袭的诱导作用。

2.4　TGF-β1对巨噬细胞诱导的淋巴瘤细胞迁移影响

图4所示，Control、TGF-β1、M2、M2+TGF-β1迁移细胞数目分别为：264.31±25.87、195.82±17.59、338.57±28.64、278.65±25.83。4组迁移细胞数目整体比较差异有显著性(F=16.723，P< 0.001)，TGF-β1迁移细胞数目明显低于Control(P< 0.05)。M2迁移细胞数目明显高于Control(P< 0.05)。M2+TGF-β1迁移细胞数目明显高于TGF-β1，并且低于M2(P< 0.05)。M2型巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞迁移，TGF-β1可以减弱M2型巨噬细胞对淋巴瘤细胞迁移的诱导作用。

注：(A)Transwell小室测定细胞迁移；(B)各组细胞迁移数目；与Control相比，aP< 0.05；与TGF-β1相比，bP< 0.05；与M2相比，cP< 0.05。图4　TGF-β1对巨噬细胞诱导的淋巴瘤细胞迁移影响Note.(A)Transwell chamber for measuring cell migration.(B)Number of migrated cells in each group. Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the TGF-β1-treated group,bP< 0.05. Compared with the M2-treated group,cP< 0.05.Fig.4　Effect of TGF-β1 on the migration of macrophage-induced lymphoma cells

图5　Western blot法测定TGF-β1对巨噬细胞培养液上清作用后的淋巴瘤细胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白水平影响Fig.5　Effect of TGF-β1 on the levels of MMP-2, MMP-9, PCNA and Ki- 67 proteins in the lymphoma cells treated with supernatant of macrophage culture fluid. Results of Western blot assay

2.5　TGF-β1对巨噬细胞培养液上清作用后的淋巴瘤细胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki-67蛋白水平影响

图5和表1所示，TGF-β1细胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki-67蛋白水平明显低于Control(P< 0.05)。M2细胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白水平明显高于Control(P< 0.05)。M2+TGF-β1细胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白水平明显高于TGF-β1，并且低于M2(P< 0.05)。M2型巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞表达MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67，TGF-β1可以减弱M2型巨噬细胞诱导的淋巴瘤细胞表达MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67作用。

3　讨论

肿瘤细胞的恶性增殖与肿瘤的发生有关，除此以为，肿瘤组织中还含有非肿瘤细胞，这些非肿瘤细胞主要由基质细胞、白细胞等组成，并且白细胞以巨噬细胞为主[10]。巨噬细胞具有多向分化潜能，在不同的微环境下，巨噬细胞的功能、活化程度等都不相同，巨噬细胞分为M1型、M2型，其中M2型与肿瘤微环境密切相关[11-14]。研究表明，M2型巨噬细胞与乳腺癌、淋巴瘤、胰腺癌等患者的预后有关，M2型巨噬细胞过多常常预示预后不良[15-17]。M2型巨噬细胞能够诱导恶性肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤的转移[18-19]。本实验结果表明，M2型巨噬细胞培养液上清处理后的淋巴瘤细胞增殖能力增加，细胞侵袭和迁移数目也增多，这与上述研究报道一致。

表1　TGF-β1对巨噬细胞培养液上清作用后的淋巴瘤细胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白水平影响

注：与Control相比，aP< 0.05；与TGF-β1相比，bP< 0.05；与M2相比，cP< 0.05。

Note. Compared with the control group,aP< 0.05. Compared with the TGF-β1-treated group,bP< 0.05. Compared with the M2-treated group,cP< 0.05.

TGF-β1具有多种调控作用，在不同的细胞中的作用不同，对细胞的增殖、分化等具有相互矛盾的双重作用，TGF-β1对上皮细胞、造血细胞、淋巴样细胞等具有生长抑制作用，而对乳腺癌细胞具有增殖促进作用[20-23]。TGF-β1在肿瘤中表达，并且对于肿瘤的调控作用具有异质性，在同种肿瘤或者不同肿瘤的不同时期，其对细胞生长的作用不同[24]。陈雨龙等[25]的研究显示，TGF-β1刺激卵巢癌A2780细胞以后，细胞在570 nm的OD值升高，细胞穿过Transwell小室膜的细胞数目增多，TGF-β1诱导A2780细胞增殖、侵袭和迁移。李柱虎等[8]用TGF-β1处理淋巴瘤细胞以后，淋巴瘤细胞的存活率降低，TGF-β1抑制淋巴瘤细胞增殖。陈元仲等[26]发现，外源性的TGF-β1可以降低白血病HL-60细胞的增殖能力。本实验结果显示，TGF-β1处理后的淋巴瘤细胞增殖能力下降，细胞迁移和侵袭能力也下降，说明TGF-β1在淋巴瘤细胞中发挥抑制作用。本实验还进一步用TGF-β1处理M2型巨噬细胞诱导的淋巴瘤细胞增殖侵袭和迁移，发现TGF-β1可以抑制M2型巨噬细胞对淋巴瘤细胞的增殖、侵袭和迁移的诱导作用。

细胞外基质的主要成分为Ⅳ型胶原酶，而MMP-2、MMP-9分别是可以降解Ⅳ型胶原酶的非糖化和糖化形式，与肿瘤的转移密切相关[27]。PCNA、Ki- 67是细胞增殖的标志蛋白，其表达水平升高后标志着细胞增殖活性增加[28-29]。本实验表明，TGF-β1降低淋巴瘤细胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白表达，并且TGF-β1还可以抑制M2型巨噬细胞诱导的淋巴瘤细胞中MMP-2、MMP-9、PCNA、Ki- 67蛋白表达，这与检测的细胞增殖、侵袭和迁移结果一致。

M2型巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞增殖、迁移和侵袭，而TGF-β1可以抑制M2型巨噬细胞对淋巴瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用，这对于以后研究肿瘤微环境在肿瘤的发生中的作用具有重要意义，本研究为以后探讨TGF-β1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定了基础。本实验只在一株淋巴瘤细胞中进行了初步研究，在以后的实验中会在多株细胞中进行验证。