亚洲象粪便中产酸克雷伯菌分离鉴定及致病性研究

2018-06-26曾邦权李维芬代飞燕

野生动物学报 2018年2期

周浪曾邦权李娟王研李维芬代飞燕*

(1.云南农业大学动物医学院，昆明，650201;2.云南省动物疫病预防控制中心，昆明，650201;3.云南省昆明市濒危动植物收容拯救中心，昆明，651700)

亚洲象(Elephas maximus)属于国家Ⅰ级重点保护野生动物，被国际自然和自然资源保护联盟(IUCN)列为濒危物种［1］。所以大象的保护和疾病监测就显得尤为重要，至今有文献记载的大象肠道菌群的研究并不多见，可以为大象疾病诊断提供的依据远远不足，本实验通过对该发病大象粪便病菌的分离和鉴定及对粪便中产酸克雷伯菌的致病性探究，初步了解大象消化道微生物菌群的结构，以及其与大象健康的关系。可为其疾病诊断提供科学依据，更是为以后的大象疾病检测增加素材和提供一定的临床指导。

克雷伯菌属(Klebsiella)有5种，分别为产酸克雷伯菌(K.oxytoca)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、植生克雷伯菌(K.planticola)、土生克雷伯菌(K.terrigena)和变形克雷伯菌(K.preteus)，后两个种属对人一般不致病［2］，产酸克雷伯菌是抗生素相关性出血性结肠炎的一种病原体。产酸克雷伯菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌属，生物学特征不同于其他克雷伯氏菌种，是重要的条件致病菌，在植物和水生环境中都能检出，也存在于人和动物的肠道，导致人畜共患病［3］。

1 材料

1.1 试验材料

本试验实验动物:亚洲象，43岁，雌性。所用病料为无菌采取的该患病大象新鲜粪便样品1份，病料来源于云南省昆明市某一公园。

1.2 主要试剂与设备

麦康凯培养基、普通肉汤培养基、DNA提取试剂盒、核酸染色剂、电热恒温培养、超净工作台、PCR仪、电泳仪、光学显微镜。

1.3 实验动物

昆明SPF小白鼠，6周龄，体重20～25 g，购于云南省昆明医科大学实验动物培育中心。

2 方法

2.1 细菌的接种培养

细菌普通培养后，挑取不同形态或具有溶血环的菌落分别接种于选择、鉴别培养基上，进行选择鉴别培养，然后再挑取这些不同形态特征或具有溶血环的菌落分别混匀于装有2～3 mL肉汤培养液的4 mL离心管中，放入37℃恒温摇床培养箱中进行细菌的扩增培养［4］。该实验共挑选了5种不同形态特征的菌落进行下一步实验，编号为①②③④⑤。

2.2 革兰氏染色镜检

涂片、干燥、初染、煤染、脱色、复染、水洗。把制作好的载玻片放在显微镜上，观察其菌落形态及菌体的颜色。

2.3 生化试验

分别挑取菌落形态与大肠杆菌(Escherichia coli)和产酸克雷伯菌相似的细菌，根据查阅相关材料获得大肠杆菌和产酸克雷伯菌常规生化试验相符的生化试验微量发酵管，将其分别接种于其中。试验结果见表1。

表1 革兰氏阴性杆菌生化试验结果Tab.1 Gram－negative bacilli biochemical test results

表2 革兰氏阳性杆菌生化试验结果Tab.2 Gram-positive bacilli biochemical test results

2.4 PCR扩增与测序

待测细菌DNA的提取;细菌DNA扩增体系配制;细菌检测PCR反应;凝胶电泳观察(PCR扩增产物电泳);测序鉴定;测序结果在NCBI上进行序列比对分析，进一步确定所分离到细菌的种属。

2.5 药敏试验

将分离纯化得到的菌株进行药敏试验，用移液枪吸取0.2 mL的菌液于普通琼脂培养基上，用无菌的三角玻璃棒均匀涂布接种，接种平板后，根据镜检结果选择针对革兰氏阴性菌窄谱、药物作用性强、不良反应少且临床上常用的10种药片进行贴片，贴上纸片15 min内，须把平板放在37℃电热恒温培养箱中倒置培养18～24 h，观察结果，并用直尺测量其直径［5－6］，结果见表 3。

2.6 动物回归实验

取纯化后的产酸克雷伯菌菌液吸取0.5 mL至装有5 mL营养肉汤的锥形瓶中，置于37℃的摇床培养箱中培养10～12 h后，取培养后的菌液0.1 mL到装有0.9 mL的无菌生理盐水的试管中充分混匀，进行10倍稀释，再从稀释后的菌液中去0.1 mL到另一管装有0.9 mL的生理盐水中，混匀，以此类推，直至稀释到1∶1013，共稀释13个梯度，然后从最后2个梯度的试管中分别吸取0.1 mL到事先高压好的普通营养琼脂平板上，每个梯度涂3个平板，用无菌三角棒进行全面涂板接种，正向放置10～15 min后倒置于37℃恒温培养箱培养18 h后进行平板计数，计数时求其平均数。计算公式为:每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×10(注意:浓度从大到小所乘倍数依次减小10倍)［7］。然后根据细菌计数结果将其稀释到2.5×1012cfu/mL进行致病性试验，以0.5 mL/只的剂量经腹腔注射给5只小鼠，作为实验组，另外设5只作为对照组，对照组每只注射0.5 mL的生理盐水，观察小鼠情况。将稀释到2.5×1015cfu/mL、2.5×1014cfu/mL、2.5×1013cfu/mL的菌液进行细菌毒力试验，取36只小白鼠随机分为6个小组，分为5个实验组和1个对照组，每组6只小鼠，实验组每只小鼠注射0.5 mL的稀释菌液，对照组每只注射0.5 mL的生理盐水，进行腹腔注射，试验组和对照组分别隔离饲养，观察一周内小鼠的情况。

2.7 病理检查

对实验组死亡小鼠进行解剖，在无菌的条件下采取病变严重部位于甲醛溶液中，送至云南省第一人民医院进行病理切片的制作，然后对病理结果进行总结分析。

2.8 目的菌的回收与鉴定

将死亡的小鼠进行解剖，取病变较为明显的肠道和肝脏组织进行实验室细菌分离鉴定培养和测序鉴定。

2.9 治疗方案

根据临床症状以及综合药敏结果建立的治疗方案如下:

① 头孢赛肟钠1 g/支 ×20;5%葡萄糖盐水500 mL×6瓶。

②10%葡萄糖 500 mL/瓶 ×6;10%NaHCO310 mL/支 ×15。

③5%葡萄糖500 mL/瓶 ×4;肌苷5 mL/支 ×2盒;辅酶A(100单位)×2盒;

ATP(三磷酸腺苷)2 mL/支×2盒。

④5%葡萄糖500 mL/瓶×3;维生素C 2 mL/支×5盒。

⑤ 痛立止10 mL/支×50支，共500 mL，分点肌肉注射。

3 结果

3.1 细菌接种培养结果

37℃培养18～24 h在普通营养琼脂培养基上得到2种菌落:一种在普通营养琼脂上形成圆形突起、光滑、湿润、半透明、灰白色、边缘整齐的，中等偏大的菌落，直径在2～3 mm之间;在伊红美蓝培养基上形成紫黑色带金属光泽的菌落;在SS培养基上和在麦康凯培养基上均形成红色菌落，但在SS培养基上生长比较贫瘠;在血平板上形成溶血环。另一种在普通营养琼脂上形成较大、凸起、灰白色黏液型的菌落，菌落大而厚实、光亮，相邻菌落容易发生融合，用接种针蘸取时可挑出长丝状细丝;在伊红美蓝培养基上形成较大、黏稠、红色、易融合成一片的菌落;在麦康凯培养基上形成粉红色黏稠菌落;在SS琼脂培养基上形成红色菌落;在血平板上形成灰白色、大而黏、光亮形成黏丝菌落(镜检图片见附件)。

3.2 革兰氏染色镜检结果

镜检观察到2类细菌形态:一类为呈革兰氏阴性无芽孢的直杆菌，两端钝圆，多散在，少成对(①、②管);另一类也为革兰氏阴性菌，但呈单个或成对，是具有荚膜无芽抱的粗短杆菌(③、④、⑤管)。细菌镜检图片见附件。

3.3 生化试验结果

能够分解葡萄糖、乳糖产酸产气;吲哚(I)和甲基红(M)试验都为阳性、VP(v)及枸椽酸盐利用(C)都为阴性;氧化酶试验为阴性;不分解甘露醇。理化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》［8］，发现分离到的菌种与大肠杆菌常规生化反应相符。

分解葡萄糖，产酸产气;靛基质反应阳性;甲基红阴性;利用枸椽酸盐和丙二酸盐;赖氨酸反应阳性;吲哚反应阳性;鸟氨酸脱氢酶反应阴性。理化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》［8］，发现分离到的菌种与产酸克雷伯菌常规生化反应相符。

3.4 PCR扩增与测序结果

采用设计的引物，以细菌核酸DNA为模板进行PCR扩增试验，结果扩增出与目的片段大小一致的DNA片段(图1)，获得核酸片段大小为1500 bp左右。送扩增的菌液至生物公司进行测序，在NCBI上比对后，发现所获得3种细菌，分别与大肠杆菌O83∶H1、大肠杆菌 O104∶H4和产酸克雷伯菌具有99%的同源性，可判定所测菌株①为大肠杆菌O83:H1、②为大肠杆菌O104:H4和③、④、⑤为产酸克雷伯菌(碱基序列见附件)。

图1 细菌PCR扩增产物琼脂凝胶电泳Fig.1 Bacterial PCR products of agar gel electrophoresis

3.5 药敏试验结果

表3 细菌药敏试验结果Tab.3 Bacterial susceptibility test results

由表3可知:该细菌对氧氟沙星、头孢曲松、头孢赛肟钠、环丙沙星、卡那霉素、磺胺异亚唑等极度敏感;对阿莫西林、多粘菌素B等高度敏感;对万古霉素等中度敏感;对甲氧嘧啶耐药。

3.6 动物回归实验

3.6.1 细菌计数结果

经18 h、37℃恒温培养后，第12个细菌稀释梯度所涂3个板长出的细菌菌落平均个数为300个左右，第13个细菌稀释梯度所涂3个板所出的细菌菌落平均个数为200个左右，因此这2个梯度的菌液浓度为2.0×103cfu/mL和3.0×103cfu/mL，可推断该菌原液浓度大约在2.0×1016～3.0×1016cfu/mL，所以将各个梯度的浓度定为2.5×1016cfu/mL、2.5×1015cfu/mL、2.5×1014cfu/mL……2.5×104cfu/mL、2.5×103cfu/mL、2.5×102cfu/mL。

3.6.2 动物回归试验结果

根据细胞计数和查阅文献，选择用3个梯度浓度的菌液分别注射给3个实验组的小鼠，每组的cfu值分别为:第一组:2.5×1015cfu/mL，第二组:2.5×1014cfu/mL，第三组:2.5×1013cfu/mL。实验小鼠在不同时间发生发病和死亡现象，第一组接种菌液后12 h开始发病，出现精神萎靡，眼部分泌物增多;14 h出现失明现象;16 h出现呼吸急促;24 h出现2只死亡;36 h出现第3只死亡;2 d后试验组6只小鼠全部死亡。第二组和第三组小鼠接种后24 h开始出现症状，出现的临床症状比第一组轻，1 d后出现死亡，4 d后实验小组全部死亡。将死亡的小鼠进行解剖，发现小鼠腹腔有黏稠的液体;胃壁增厚、肿大;部分肠管扩张，内有大量黄色黏液;肝脏部分坏死;脾脏出血;心脏肺脏出血。根据解剖症状，采取了小鼠的肠道、肝脏肺脏进行了鉴别培养和测序鉴定，结果是所检测样品全都为产酸克雷伯菌(解剖图片见附件)。

3.6.3 毒力性试验结果

每组小鼠在注射0.5 mL不同梯度菌液后，不同梯度菌液注射的小鼠出现在不同的时间发病或死亡现象。根据各组小鼠死亡情况，计算出最小致死量(MLD)，依照寇氏改良法计算公式:LD50=log－1［Xm－i(Pm－0.5)］(Xm代表最大剂量的对数;i代表组距，即相邻2个组对数差;Pm代表各组死亡率之和)计算出半数致死量(LD50)［10］结果表明。

表4 感染克雷伯菌小鼠的死亡情况Tab.4 Deaths of infected Klebsiella mice

表5 致死量测定结果Tab.5 Lethality measurement results

3.7 病理检查结果

图2 肠壁(100×)Fig.2 Bowel wall(100×)

图3 肺部(100×)Fig.3 Pulmonary(100×)

肺部(200×)Pulmonary(200×)

图4 肝脏(100×)Fig.4 Liver(100×)

肝脏(200×)Liver(200×)

图5 心脏(200×)Fig.5 Heart(200×)

心脏(400×)Heart(400×)

由以上组织切片结果可知:小鼠主要病变部位变化为肠壁部分黏膜自溶，慢性炎细胞浸润;肺局灶血管旁少量炎细胞散在浸润;肝细胞浊肿，可见双核和核大肝细胞;心脏充血，局灶心肌纤维变性。可见小鼠病理变化主要以炎性反应为主，引起肿大充血和变性。

3.8 目的菌回收结果

将实验过程中死亡的实验组小鼠进行解剖，取肠道和肝脏所分离到的细菌，鉴别培养后进行纯化扩增，送扩增的菌液至生物公司进行测序，在NCBI上比对后，确定其就是产酸克雷伯菌，说明实验组小鼠死亡是由产酸克雷伯菌感染引起的。

3.9 治疗结果

经过提出的治疗方案进行了为期一周的治疗，最后该患病大象基本恢复正常。

4 讨论与分析

该大象在此之前一直有做定期细菌检测，在之前的记录中，其粪便中都存在有大肠杆菌O83∶H1和大肠杆菌O104∶H4等这些常见致病菌，但是该大象之前并未出现便血症状，所以本次实验主要以产酸克雷伯菌的分离鉴定及其致病试验研究展开的。

从死亡小鼠解剖结果来看，产酸克雷伯菌侵害的部位主要是肠道、肝脏和肺脏，主要表现为肠道水肿，内有大量黄色黏液;肺部点状出血和肝脏部分坏死。用前3个梯度浓度的菌液注射的小鼠，在接种后的48 h内全部死亡，其他梯度浓度的菌液所注射的小鼠都表现出了轻微或严重的临床症状，最后均发生死亡，说明该菌对小鼠易感且致病性较强，这跟Bleich等［11］和 Foreman 等［12］的研究是具有一致性的。

［1］张立．中国亚洲象现状及研究进展［J］．生物学通报，2006，41(11):1－3．

［2］赵思越，段刚，项勋，等．红嘴鸥产酸克雷伯菌的生物学特性［J］．养殖与饲料，2014(12):19－21．

［3］方文珍，陈志鸿，陈小麟，等．厦门滨海湿地冬季鸟类群落多样性研究［J］．海洋科学，2007，31(1):10－16，27．

［4］杨汉春．兽医微生物学和免疫学［M］．北京:中国农业出版社，2016:11－12．

［5］刘玉涛，吴学敏，陈如敬，等．福建省鸡源大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］．中国农学通报，2014，30(2):65－68．

［6］赵明礼．牛源性致病性大肠杆菌的分离鉴定及E.coli O157∶H7生物学特性研究［D］．哈尔滨:东北农业大学，2013．

［7］赵冉冉，钟廷，张文华．模拟生物进化机制的探究实验［J］．中学生物学，2014，30(10):45－46．

［8］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［M］．8版．北京:科学出版社，2001．

［9］王双山，张敬礼，刘庆昌，等．肉鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］．河南农业科学，2003(6):43－45．

［10］张成栋．I型菌毛介导鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的毒力及对抗原递呈细胞侵袭力的研究［D］．武汉:华中农业大学，2009:35．

［11］ Bleich A，Kirsch P，Sahly H，et al．Klebsiella oxytoca:opportunistic infections in laboratory rodents ［J］．Laboratory Animals，2008，42(3):369－375．

［12］ Foreman O，Kavirayani A M，Griffey S M，et al．Opportunistic bacterial infections in breeding colonies of the NSG mouse strain［J］．Veterinary Pathology，2011，48(2):495 －499．

附件:

细菌分离鉴定结果图片