常山口服液抗鸡柔嫩艾美耳球虫广东分离株的疗效研究

王 玲，郭志廷*，龚振兴，蔡建平，杨 峰

(1. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃 兰州，730050;2. 中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州，730046)

中药常山为虎耳草科植物常山(DichroafebrifugaLour.，DFL)的干燥根，味苦辛，性寒，具有杀虫、截疟、祛痰之功效[1]。常山作为具有抗球虫活性的中药材，可单独使用或作复方制剂的主药使用，而有效活性单体常山碱(即常山碱乙或常山乙素，febrifugine，dichroine B，β-dichroine)和异常山碱(即常山碱甲，isofebrifugine，dichroine A，α-dichroine)即为常山提取物中的抗球虫有效组分[2-4]。鸡球虫病是一种全球流行、发病率高和死亡率高的肠道寄生虫病，全球每年因该病造成的经济损失约为50亿美元，我国在30亿元左右，其中抗球虫药物费用约为6亿元。目前鸡球虫病防治主要依靠化学药物，包括地克珠利、妥曲珠利及常山碱衍生物(如常山酮)等[5-6]。鉴于抗球虫化学药物存在严重的耐药性和药物残留，且中药复方中抗球虫有效活性成分常山碱的含量偏低，目前迫切需要研发新型安全高效的抗球虫药物。应用现代中药分离技术，提取中药常山的有效活性成分常山碱，通过优化生产工艺制备常山口服液，并将其用于防控鸡球虫病，具有抗球虫疗效好、低毒低残留和不易产生耐药性等优点。本试验拟通过人工感染鸡柔嫩艾美艾球虫(E.tenella)复制病理模型，探讨常山口服液对鸡球虫病的临床疗效，并确定最佳给药剂量，以期为今后常山口服液作为抗球虫新兽药的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1日龄的岭南黄雏鸡120只，购自甘肃省兰州华陇家禽育种公司。雏鸡饲料购自兰州市富昌饲料厂，未添加任何抗球虫药物。饲养条件与管理：在中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所标准化实验动物房(经严格消毒，无鸡球虫卵囊污染环境)，隔离笼养。按常规饲喂饲料，自由采食饮水，饲养至14日龄，按体重随机分组，分笼饲养。

1.2 试验药物 常山口服液，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室制备，黄色液体，常山碱含量为2.2 mg/50 mL。主要制备过程：常山提取物，加入1.0%的无水酒精助溶剂和4.0%的双乙酸钠防腐剂，调节pH值至7.2，过滤、分装、冷藏，备用。

对照药物：百球清(妥曲珠利溶液，口服制剂，含量2.5%)，购自拜耳(四川)动物保健有限公司，按生产厂家推荐剂量1.0 mL/L水，饮水给药。

1.3 试验虫株 柔嫩艾美耳球虫广东株(1996年分离自广东花都，对尼卡巴嗪轻度抗药，对常山酮和克球粉中度抗药，对球痢灵、氯羟吡啶、马杜拉霉素、拉沙洛菌素、盐霉素、莫能霉素严重抗药)，由中国农业科学院兰州兽医研究所蔡建平研究员提供。

1.4 抗球虫试验

1.4.1 分组与给药 雏鸡饲养至12日龄时，连续两天对试验鸡进行粪便检查，确定无球虫感染后，于14日龄开始试验。感染前选取90只健康无球虫雏鸡，饲喂前2 h禁止摄入饲料和水，逐只称重。选取体重相近雏鸡，随机分为9个组，每组10只。常山口服液6个药物剂量组(分别为2.5、5.0、15.0、25.0、35.0、50.0 mL/L水，饮水给药)、妥曲珠利对照组(1.0 mL/L水，饮水给药)、攻虫不给药组(感染对照组)和不攻虫不给药组(健康对照组)。除不攻虫不给药组外，其余各感染组每只鸡经口接种完全孢子化卵囊7×104个(卵囊为柔嫩艾美耳球虫广东株球虫孢子化卵囊)，接种24 h后，开始给药，连续给药7 d。第8天试验结束时，对每组存活鸡进行单只称重，统计存活率，计算各组相对增重率。

1.4.2 临床及病理剖检观察 接种柔嫩艾美耳球虫后，观察和记录各组试验鸡的发病情况及临床表现。感染后第3天，每天检查粪便，记录血便情况，直至试验结束。感染后第5～8天，每天收集粪便称重，用麦氏虫卵计数法(McMaster's法)计算每克粪便卵囊数(Oocysts per gramme，OPG)。试验结束时(球虫感染第8天)，每组存活鸡逐只称重后，全部扑杀，剖检记录盲肠病变值，同时，收集各组盲肠内容物及粘膜上皮组织，进行盲肠内容物称重及盲肠卵囊数量检测等。

1.4.3 药物疗效评定指标和标准 试验鸡称重分别于感染前和试验结束逐只称量雏鸡体重。按以下公式计算相对增重率。增重率=(试验结束后平均体重-试验开始时的平均体重)/试验开始时的平均体重×100%，相对增重率=(感染试验组的平均增重÷健康对照组平均增重)×100%

存活率：存活率(%)=(存活鸡只数/开始鸡只数)×100%。

病变记分：试验期间每日观察各组鸡的精神、食欲、粪便、死亡等情况，并记录结果，对试验期间死亡的鸡进行尸体解剖。参考Johnson & Reid(1970)评价标准[7-8]，根据剖检后肠道病变的严重程度对每组鸡盲肠进行病变计分。病变记分在0～4+范围之内，0表示无肉眼病变；4+表示最严重病变，盲肠出血严重，高度肿胀，肠腔内充满凝血及黏膜碎片。试验中因球虫病死亡的鸡只，其肠道病变记分均记为4分。病变值：每组鸡的平均病变记分×10。

血便记分：参照Morehouse和Baron(1970)评价标准[7,9]，非正常粪便记分在0～4+范围之内，0表示未见异常，粪便不带血；4+表示最严重的异常稀粪，粪便中带有血液和黏液。

卵囊值[7,10]：按角田清(1986)方法计算，以感染对照组的卵囊量为100%(40分)，卵囊比数为0～1%(卵囊值记为0)；卵囊比数为1%～25%(卵囊值记为5)；卵囊比数为26%～50%(卵囊值记为10)；卵囊比数为51%～75%(卵囊值记为20)；卵囊比数为76%～100%(卵囊值记为40)。卵囊值=(试验组卵囊/感染对照组卵囊)×100%。

效果判定：根据各组试验鸡的相对增重率、存活率、病变值和卵囊值，按美国Merck公司的方法，计算抗球虫指数(Anticoccidial index, ACI)[7]。以ACI为标准判定药物疗效，ACI≤120为无效；ACI介于120～160为低效；ACI介于160～180为中效；ACI>180为高效。ACI=(相对增重率+存活率)×100-(病变值+卵囊值)。

2 结果与分析

2.1 临床症状及血便情况 接种球虫后第3天，除健康对照组鸡只外，其他感染试验组鸡只均表现出不同程度的临床症状，如采食量减少、羽毛蓬乱、两翼下垂、缩头缩颈、闭眼昏睡、不愿走动、离群呆立、排血便等情况。

接种球虫后第4天和第5天，除健康对照组粪便记分为0外，感染对照组鸡只仍表现排出大量血便症状(粪便记分为4)，所有药物剂量组的鸡只其血便明显减少，精神状况和采食量出现明显好转迹象(粪便记分为3)。

2.2 病理解剖学变化 病理解剖发现，所有健康对照组试验鸡只，其脏器均正常。感染对照组试验鸡只，盲肠和十二指肠显著肿胀，内含大量血样内容物。所有药物剂量组试验鸡只，盲肠及十二指肠亦出现肿胀、血样性内容物，但病变程度较感染对照组明显减轻，其他脏器未见明显眼观病变。病变值见表1。

2.3 抗球虫及促生长效果 通过相对增重率、存活率、卵囊值和病变值等指标计算ACI，由表1可知，常山口服液各药物剂量组的ACI值分别为87.7、136.2、141.8、136.2、109.7和108.0，均高于感染对照组；常山口服液按5.0、15.0和25.0 mL/L水的剂量饮水给药，其ACI值均高于妥曲珠利药物组(ACI值为124.8)。用药各组鸡(除2.5 mL/L药物剂量组外)增重明显高于感染对照组，其中以15.0 mL/L药物剂量组鸡增重最快，比对照药妥曲珠利组鸡高12.5%。

表1 常山口服液抗柔嫩艾美耳球虫疗效试验结果Tab 1 Curative effect on anticoccidial of Radix dichroa oral liquid (RDOL) to E.tenella in chickens

3 讨 论

球虫病是危害极大、呈全球性分布的禽类传染病之一，可导致家禽生长受阻、饲料转化率降低和肉蛋品质下降。在所有的鸡球虫属中，柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)对鸡危害最为严重[11]。目前，国内外主要利用化学合成药物来预防和治疗鸡球虫病，如地克珠利、妥曲珠利和常山酮等，对上述药物的抗球虫作用及机理研究较多[12]。

中药和化学合成药物在防治球虫病的过程中，由于来源不同，其作用效果、作用机制和治病理论存在很大差别，在防治疾病过程中中药一般表现多靶点、多途径和协同作用的特点。按照中兽医辨证施治理论，鸡球虫病为外感湿热，湿热蕴集大肠，热毒迫血妄行，导致粪便带血，湿困脾土，致使鸡群下痢，其治疗原则应以清热燥湿、凉血止痢为主。中药常山是我国著名的截疟祛痰药，中医主要用于抗疟疾和退热药物使用[13]。研究表明，由常山中分离提取出的常山碱具有良好的抗球虫效果，其作为一种新型的ATP依赖性抑制剂所具有的定向捕获作用可能也适用于人类其他tRNA合成酶，这一重大发现揭示了常山碱及其衍生物发挥抗疟疾、抗球虫等生物学功效的可能作用机理[14]。前期药理试验证实，纯度为0.24%的常山碱提取物按照0.1 g/kg的剂量饲料拌服给药，对人工感染鸡柔嫩艾美耳球虫发病的试验鸡只具有良好的治疗效果；免疫学试验表明，常山碱可显著促进小鼠脾细胞的增殖反应和巨噬细胞的免疫功能；毒理学试验表明，常山提取物毒性较低，临床用药安全可靠[15]。

试验结果表明，常山口服液按5.0、15.0和25.0 mL/L水剂量饮水给药，可以提高试验鸡只的增重率，对人工感染E.tenella的发病试验鸡只具有良好的治疗效果。但本次试验所有给药组的ACI值均低于160，可能与所用虫株的毒力有关。柔嫩艾美耳球虫广东株自上世纪90年代中期分离得到，蔡建平研究员课题组长期以此虫株进行鸡球虫病的研究[16]，此虫株毒力较强，每只鸡经口感染7万个新鲜孢子化卵囊(1个月内)，死亡率介于10%～20%。通常在药物抗球虫疗效试验设计中，感染对照组(攻虫不给药)以5～10%的死亡率为最佳，然而此次试验中，设计的攻虫剂量为7×104个孢子化卵囊，感染对照组的死亡率达到30%，说明实际攻虫剂量偏大。尽管此次预试验结果中对照药物和试验药物的ACI值都偏低，但仍可从结果中获得剂量与抗球虫效果之间的关系，即常山口服液按5.0、15.0和25.0 mL/L水剂量，饮水给药，具有良好的抗球虫效果。结合临床用药成本，我们确定常山口服液的最低有效给药剂量为5.0 mL/L水。

通过抗球虫疗效观察试验，结果提示，人工感染条件下，常山口服液能有效预防鸡球虫病，较化学药物妥曲珠利具有更好的抗球虫疗效和促生长作用，且作为中药提取物，使用安全范围大，疗效对比试验效果理想，有望成为新型抗球虫药物。

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