枸橼酸碘溶液对4种病原菌的载体消毒效果研究
2018-06-23李亚菲曾振灵梁先明谭志坚
李亚菲,曾振灵,梁先明,谭志坚,贾 谏
(1.华南农业大学兽医学院,广州 510642;2.广东省农业科学院农产品公共监测中心,广州 510640;3.中国兽医药品监察所,北京 100081;4.佛山市正典生物技术有限公司,广东佛山 528138)
现代化养殖业中,养殖场使用消毒剂净化畜禽生长环境、消除病原微生物、减少病原菌的入侵、阻止疾病的引入和传播,从而预防和控制畜禽传染病的发生[1-3]。科学选择和合理使用消毒剂,对于做好养殖场的消毒净化工作以及疫病的预防、控制、扑灭起到至关重要的作用[4]。碘类化合物作为消毒剂的一种,已广泛应用于生产,其作用原理是通过氧化、碘代反应破坏细胞结构和酶系统等,从而达到杀菌目的[5-6]。有研究表明,柠檬酸作为一种弱有机酸,也具有一定的抗菌作用[7]。将两者制成复方消毒剂,克服了含碘消毒剂不稳定、易受环境酸碱性影响且容易产生刺激性和腐蚀性等缺点,以期达到高效、广谱、低毒的特点。我国农业部1992年颁布了《兽用消毒剂鉴定技术规范》,详细介绍了评价兽用消毒剂的试验方法。试验方法与卫生部颁布的《消毒技术规范》相似,包括对细菌、芽孢、病毒作用效果的试验方法。根据以上标准,本研究评价复方枸橼酸碘溶液对4种病原菌的消毒效果,同时选择国外产品百胜-30溶液作为对照,进行载体消毒试验,以期为该药在临床的应用提供依据和参考。
1 材 料
1.1 供试药品 枸橼酸碘溶液:含碘2.0%,佛山正典生物技术有限公司生产,批号1211070。百胜-30溶液:含碘3.0%,英国Evans生产,批号14744。
1.2 供试菌株 大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC6538、马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC556、蜡样芽孢杆菌8008,均为专用消毒剂鉴定菌种,购自中国兽医药品监察所。
1.3 主要试剂 营养肉汤、营养琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤、胰蛋白胨大豆琼脂,购自广州环凯微生物科技有限公司,新生小牛血清购自北京普博欣生物科技有限公司,无菌脱纤维绵羊血购自广州蕊特生物有限公司,其他分析纯试剂磷酸氢二钠、氯化钠购自广州化学试剂厂,无水氯化钙和氯化镁购自天津市科密欧化学试剂有限公司,磷酸二氢钾购自成都市科龙化工试剂厂,吐温-80购自天津市化学试剂三厂,硫代硫酸钠购自天津市大茂化学试剂厂。
1.4 主要仪器 微量移液器:法国吉尔森公司;超净工作台:苏州净化设备有限公司;SN510C高压灭菌锅:日本YAMATO公司;FA2004N型电子分析天平:上海精密科学仪器有限公司;数显隔热式培养箱:上海锦屏仪器仪表有限公司通州公司;HZQ-F160全温振荡培养箱:扬州市培英实验仪器有限公司;涡旋混合器:德国IKA公司;电子计时器:杭州精诚三合实业有限公司;显微镜:日本OLYMPUS公司。
1.5 溶液配制 标准硬水(硬度342 mg/L):无水氯化钙0.304 g,氯化镁0.139 g,蒸馏水加至1000 mL,121 ℃灭菌20 min即可。磷酸盐缓冲溶液(0.03 mol/L,pH 7.2):十二水合磷酸氢二钠7.13 g,磷酸二氢钾1.36 g,蒸馏水加至1000 mL,121 ℃灭菌20 min即可。
2 试验方法
载体消毒试验方法,根据试验指导原则进行[8]。
2.1 菌种的制备
2.1.1 细菌繁殖体悬液的制备 取冻干菌种管,在无菌操作下打开,加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散。接种菌悬液于合适的液体培养基,置37 ℃培养18~24 h。用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于合适的固体培养基平板上,于37 ℃培养 18~24 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落,接种于合适的固体培养基平板上,于37 ℃培养18~24 h,即为第3代培养物。取第3~14代的固体培养基平板上的新鲜培养物(18~24 h)进行试验。将上述经传代后的菌种接种到合适的液体培养基,37 ℃培养18~24 h即得到细菌悬液。悬液应当天使用不得过夜。
2.1.2 细菌芽孢悬液的制备 取冻干菌种管,在无菌操作下打开,加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散。接种菌悬液于合适的液体培养基,置37 ℃培养18~24 h。用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于合适的固体培养基平板上,于37 ℃培养 18~24 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落,接种于合适的固体培养基平板上,于37 ℃培养5~7 d后挑取少许菌苔作芽孢染色镜检。当每个视野内的芽孢数达90%~95%以上时,可收集芽孢。
芽孢染色方法:①用接种环蘸取菌样涂布于玻片上,待自然干燥。然后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内,片上放两层滤纸,滴加足量的 5.0% 孔雀绿水溶液。将平皿盖好,放54~56 ℃ 条件下,加热 30 min。取出,去滤纸,用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5% 沙黄水溶液,染1 min。水洗,待干后镜检。芽孢呈绿色,菌体呈红色。
芽孢收集方法:在无菌操作下于琼脂培养基平板中加入4.0 mL无菌蒸馏水,使其浸润菌苔,再以涂布棒轻轻推刮下菌苔(小心勿将琼脂刮破)。吸取第1批洗下的菌悬液于无菌离心管中,再加4.0 mL无菌蒸馏水重复洗一遍。将第1和第2批洗下的菌悬液集中于一个无菌离心管内,以3000 r/min速度离心10 min。弃上清液,加入少量无菌蒸馏水悬浮菌体,再离心,如此重复3次。最后将浓缩的芽孢悬液置于80 ℃水浴中 10 min,以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后,保存于4 ℃冰箱中备用。芽孢悬液在使用时,应先进行活菌培养计数。
2.2 中和剂筛选实验 以大肠杆菌8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538为指示菌。中和剂拟采用含硫代硫酸钠、吐温-80的营养肉汤,使用前高压灭菌。消毒剂用无菌硬水稀释为一定浓度,稀释液用0.03 mol/L的无菌磷酸盐缓冲液。试验按以下分组进行:第一组:消毒剂+菌悬液。吸取1.0 mL试验菌悬液与4.0 mL消毒剂于试管内,涡旋20 s,混匀。作用至预定时间,吸此样液0.5 mL加于含有4.5 mL稀释液的试管中,混匀。吸取该最终样液0.1 mL涂布于琼脂平皿中,置37 ℃培养计数。第二组:(消毒剂+菌悬液)+中和剂。吸取1.0 mL试验菌悬液与4.0 mL消毒剂试管内,混匀。作用至预定时间,吸此样液0.5 mL加于含4.5 mL中和剂溶液试管中,涡旋20 s,混匀,作用10 min。吸取该最终样液0.1 mL涂布于琼脂平皿中,置37 ℃培养计数。第三组:中和剂+菌悬液。吸取0.1mL试验菌悬液与4.9 mL中和剂于试管内,涡旋20 s,混匀,作用10 min。吸取该最终样液0.5 mL,用中和剂做10倍系列稀释,选适宜稀释度悬液,各吸取0.1 mL涂布于琼脂平皿中,置37 ℃培养计数。第四组:中和产物+菌悬液。吸取0.1 mL试验菌悬液与4.9 mL中和产物溶液(以0.4 mL消毒剂加4.5 mL中和剂,作用10 min 配制而成)于试管内,混匀。作用10 min,吸取该最终样液0.5 mL,用中和产物溶液做10倍系列稀释,选适宜稀释度悬液,各吸取0.1 mL涂布于琼脂平皿中,置37 ℃培养计数。第五组:稀释液+菌悬液。吸取0.1mL试验菌悬液与4.9 mL稀释液于试管内,作用10 min。吸取该最终样液0.5 mL,用稀释液做10倍系列稀释,选适宜稀释度悬液,各吸取0.1 mL涂布于琼脂平皿中,置37 ℃培养计数。第六组:空白对照组。分别取中和剂、稀释液、无菌硬水0.1 mL涂布于琼脂平皿中,置37 ℃培养计数。
2.3 载体消毒实验
2.3.1 载体制作 根据试验目的、可能性、需要以及制作的可行性,选用橡胶片作为载体制作菌片,用橡胶手套剪制成大小为0.5×1.0 cm2,先脱脂,即用1%洗衣粉溶液煮沸30 min,再用自来水洗净。用蒸馏水再煮沸10 min,再漂洗3次。晾干。
2.3.2 染菌 把预先培养好的菌液稀释好,将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内,逐片滴加菌液。每片滴加菌液10 μL。用10 μL移液器接灭菌塑料吸头滴染菌液,并用接种环涂匀整个载体表面,染菌105~106个以上,并使之分布均匀。滴染菌液后,染菌载体可置37 ℃温箱内干燥(约20~30 min)备用。
2.3.3 消毒 将消毒液按预先的浓度稀释好,再将菌片浸入消毒液中,放入恒温箱内,立即记时。以0.03 mol/L磷酸盐缓冲液代替消毒液,作为对照组。
2.3.4 中和与培养 定性试验:作用预定时间后,将菌片分别放入含足量中和剂的试管,中和10 min,再取出放入液体培养基内,置37 ℃培养24 h。若发生混浊即表示有细菌生长。必要时,可移植到固体培养基上,观察菌落形态,或进行涂片染色镜检,以判断生长的是否为试验菌,以排除污染。若肉汤不变混浊,应继续培养至第7天,若仍不混浊方可判为无菌生长。
定量试验:根据定性试验结果初步判定消毒剂作用时间和浓度,进行定量试验。取出菌片放于有玻璃珠的中和液内,振摇100次洗脱载体上的细菌,然后进行活菌计算及统计分析。以无菌生长管消毒液的最低浓度为最低杀菌有效浓度,以无菌生长管的最短消毒时间为该浓度杀菌最快有效时间。
杀菌率的计算:根据活菌计数的结果,计算杀菌率(Pt)。消毒t时的杀菌率(Pt)=[(n0-nt)/n0]×l00%,式中n0为消毒前或对照组活菌数。nt为消毒后或实验组活菌数。
3 结果与分析
3.1 中和剂鉴定试验 中和剂的鉴定选择大肠杆菌8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538为代表进行试验。试验中所用消毒剂的浓度为杀菌试验中使用的最高浓度,即针对大肠杆菌8099,2%柠檬酸碘溶液按1∶2500稀释,百胜-30溶液按1∶3750稀释。针对金黄色葡萄球菌ATCC6538,2%柠檬酸碘溶液按1∶5000稀释,百胜-30溶液按1∶7500稀释。
结果表明,含0.3%硫代硫酸钠、1%吐温-80的灭菌营养肉汤中和剂可以有效中和2%柠檬酸碘溶液。含0.5%硫代硫酸钠、1%吐温-80的灭菌营养肉汤中和剂可以有效中和剂百胜-30溶液。以上两种中和剂、中和产物对细菌生长无明显影响(表1)。
表1 中和剂鉴定试验结果Tab 1 The test for the identification of neutralizer
试验条件均为20±1 ℃,作用时间为5 min;以上结果为3次试验的平均值
3.2 定性试验结果 在室温条件下(20 ℃左右),在橡胶片载体上时,对于大肠杆菌8099,2%枸橼酸碘溶液最低杀菌有效浓度为1∶320,该浓度的最短消毒时间为5 min;对于金黄色葡萄球菌ATCC6538和马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC 556,2%枸橼酸碘溶液最低杀菌有效浓度为1∶640,该浓度的最短消毒时间为5 min。对照组百胜-30溶液按1∶1920稀释时,对上述三种菌株的作用时间为1 h;当浓度提高到1∶960时,对三种菌的最短作用时间是5 min。对于蜡样杆菌芽孢,2%枸橼酸碘溶液最低杀菌有效浓度为1∶1,该浓度的最短消毒时间为10 min;对照组百胜-30溶液最低杀菌有效浓度为1∶1,该浓度的最短消毒时间为30 min。详细结果见表2~表4。
表2 2%枸橼酸碘消毒剂对三种细菌定性杀菌效果Tab 2 The qualitative germicidal effect of 2% citrate iodine solution on three kinds of bacteria
A代表大肠杆菌8009,B代表金黄色葡萄球菌ATCC6538,C代表马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC556;“+”表示有细菌生长,“-”表示无细菌生长;阳性对照均浑浊;表内结果是3次试验的平均值
表3 百胜-30消毒剂对三种细菌定性杀菌效果Tab 3 The qualitative germicidal effect of Bai Sheng-30 solution on three kinds of bacteria
此消毒剂含碘量为3%,按照最终含碘量一致的原则,稀释倍数参考受试消毒剂;A代表大肠杆菌8009,B代表金黄色葡萄球菌ATCC6538,C代表马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC556;“+”表示有细菌生长,“-”表示无细菌生长;阳性对照均浑浊;表内结果是3次试验的平均值
表4 两种消毒剂对蜡样芽胞杆菌8008定性杀菌效果Tab 4 The qualitative germicidal effect of two kinds of solutions on Bacillus cereus 8008
“+”表示有细菌生长,“-”表示无细菌生长。阳性对照均浑浊。表内结果是3次试验的平均值
3.3 定量试验结果 对四种病原菌的杀灭效果见下表5~表6。在室温条件(20 ℃左右)、橡胶片载体上时,对于大肠杆菌8099,2%枸橼酸碘溶液按1∶500稀释,5 min杀灭率均达99.90%以上,当稀释倍数再提高,即使作用时间延长,其杀菌率也不能达标;对照消毒剂百胜-30溶液按照1∶900稀释,5 min杀灭率也达99.90%以上(表5)。
如表5所示,对于金黄色葡萄球菌ATCC6538,2%枸橼酸碘溶液按1∶1000稀释,5 min杀灭率均达99.90%以上,当稀释倍数提高到1∶1200,最低作用时间是10 min,相对应的百胜-30溶液按照1∶1800稀释,最低作用10 min,杀菌率才能达标,即使提高消毒剂浓度,最低作用10 min,其杀菌率才能达99.90%以上。对于马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC 556,2%枸橼酸碘溶液按照1∶1200稀释,30 min杀灭率达99.90%以上,当浓度再提高至1∶800以上时,作用10 min杀灭率均达99.90%以上,相对应的百胜-30溶液,按照1∶1800稀释时,5 min杀灭率均达99.90%以上。
如表6所示,对于蜡样杆菌8008芽孢,枸橼酸碘溶液按1∶10稀释,1.5 h杀灭率才达99.90%以上,当药物浓度提高到1∶8以及更高浓度时,作用30 min杀灭率才能达标;对照组百胜-30溶液,按1∶10稀释时,作用1.5 h,杀灭率才达99.90%以上,当药物浓度提高1∶6稀释时,作用1 h,杀灭率才能达标。
表5 两种消毒剂对三种细菌定量杀菌试验结果Tab 5 The quantitative germicidal effect of two kinds of solutions on three kinds of bacteria
对照组菌数为106CFU/mL;枸橼酸碘溶液按1∶300、1∶400、1∶500、1∶600稀释后,分别与百胜-30溶液按1∶450、1∶600、1∶750、1∶900稀释后,最终碘含量一致。枸橼酸碘溶液按1∶600、1∶800、1∶1000、1∶1200稀释后,分别与百胜-30溶液分别按1∶900、1∶1200、1∶1500、1∶1800稀释后,最终碘含量一致;表内结果是3次试验的平均值
表6 两种消毒剂对蜡样芽胞杆菌8008芽孢定量杀菌试验结果Tab 6 The quantitative germicidal effect of two solutions against Bacillus cereus 8008
对照组菌数为106CFU/mL;枸橼酸碘溶液与百胜-30分别按1∶6、1∶8、1∶10、1∶12稀释;表内结果是3次试验的平均值
4 讨论与小结
影响消毒剂杀菌作用的因素有药物浓度、作用时间、温度等[9]。微生物附着于不同的载体,也会影响消毒和灭菌效果[10-11]。本试验初步证明了受试菌株(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、马腺疫链球菌和蜡样芽胞杆菌)附着在橡胶片载体上时,枸橼酸碘溶液和百胜-30溶液的杀菌效果。上述试验结果是建立在两种消毒剂按一定比例稀释后,最终碘含量一致的前提下(将枸橼酸碘溶液稀释为相应倍数时,消毒剂百胜-30溶液稀释倍数为上述消毒剂稀释倍数乘以1.5)得到的。对于蜡样芽胞杆菌,在定性试验中,消毒剂百胜-30稀释倍数为1∶1时,作用10 min也无作用,因此,在定量试验中,其稀释浓度相应提高,稀释倍数与受试组药物一致。
通过载体定性、定量杀菌实验得出,在橡胶片载体上时,对于大肠杆菌8099,枸橼酸碘溶液按1∶500稀释,5 min杀灭率均达99.90%以上;对于金黄色葡萄球菌ATCC6538,枸橼酸碘溶液按1∶1000稀释,5 min杀灭率均达99.90%以上;稀释倍数为1∶1200时,最低作用10 min,杀菌率才能达到99.90%;对于马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC 556,枸橼酸碘溶液按照1∶1200稀释,30 min杀灭率均达99.90%以上,当药物浓度提高至1∶800以上时,作用10 min杀菌率即可达到99.90%以上;对于蜡样杆菌8008芽孢,枸橼酸碘溶液1∶10稀释,1.5 h杀灭率才达99.90%以上,当药物浓度提高到1∶8及以上时,作用30 min杀灭率才能达标。
对照百胜-30溶液对大肠杆菌的杀灭效果要明显强于枸橼酸碘溶液;对金黄色葡萄球菌的杀灭效力与枸橼酸碘溶液相比,起作用时间略晚一些;对马腺疫链球菌兽疫亚种强毒,对照百胜-30溶液比枸橼酸碘溶液稍好;对蜡样芽孢,枸橼酸碘溶液的杀灭效果比百胜-30溶液的杀灭效果略好。建议养殖场使用消毒剂前,综合考虑本场微生物污染的情况,合理选择消毒剂。此外,应交替使用不同的消毒剂,避免因长期使用一种消毒剂导致耐药菌产生,影响消毒效果。选择复方枸橼酸碘溶液进行消毒时,应确保消毒剂使用浓度和作用时间。
参考文献:
[1] 佟海山,陈遇英. 我国兽用消毒剂的应用现状与对策[J]. 中国兽医杂志,2017,53(9):115-117.
Tong H S, Chen Y Y. The application status and countermeasures of veterinary disinfectant in China [J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2017, 53(9): 115-117.
[2] 李亚菲,吴维煇,张 展,等. 广东省养禽场兽药使用现状调查[J].中国家禽,2017, 39(1):70-74.
Li Y F, Wu W Y, Zhang Z,etal. Investigation on the usage of veterinary drugs in poultry farms in Guangdong province[J]. China Poultry, 2017, 39(1): 70-74.
[3] 陈小强,王晶钰,张中航,等. 规模化鸡场消毒剂的筛选与消毒效果评价[J].动物医学进展,2011,32(11):85-89.
Chen X Q, Wang J Y, Zhang Z H,etal. Evaluation on selection of disinfectant and disinfection effects in scaled chicken farms [J]. Progress in Veterinary Medicine, 2011, 32(11): 85-89.
[4] 冯忠武. 合理选择和安全使用兽用消毒剂[J]. 中国畜牧杂志, 2006, 42(21): 60-61.
Feng Z W. Reasonable choice and safe use of veterinary disinfectant [J].China Academic Journal, 2006, 42(21): 60-61.
[5] 徐庆华. 含碘消毒剂及其应用技术[J]. 中国消毒学杂志, 2012, 29(4): 316-318.
Xu Q H. Iodine disinfectant and its application technology [J]. Chinese Journal of Disinfection, 2012, 29(4): 316-318.
[6] 岳欣荣,张义冉,贾立财,等. 蛋鸡养殖场常用聚维酮碘类消毒剂的质量评估[J]. 中国家禽, 2015, 37(20): 57-59.
Yue X R, Zhang Y R, Jia L C,etal. Quality assessment of polyvidone iodine solution used in laying farms [J]. China Poultry, 2015, 37(20): 57-59.
[7] 王 晓,赖发伟,杨 宁,等. 柠檬酸与热力协同消毒作用相关性能试验研究[J]. 中国消毒学杂志, 2013, 30(1): 6-8.
Wang X, Lai F W, Yang N,etal. Reseach on synergy disinfextion effect and related performance of citric acid and thermal [J]. Chinese Journal of Disinfection, 2013, 30(1): 6-8.
[8] 农业部兽药评审中心. 兽药注册资料汇编[M]. 北京: 农业部兽药评审中心, 2009.
Center for Veterinary Drug Evaluation Ministry of Agriculture. Technical requirements assembly of veterinary drug Registration [M]. Beijing: Center for Veterinary Drug Evaluation Ministry of Agriculture, 2009.
[9] 夏娌君,原 霖,肖志明,等. 戊二醛季铵盐复方消毒剂杀菌效果及影响因素[J]. 中国兽医杂志, 2010,46 (7):58-60.
Xia L J, Yuan L, Xiao Z M,etal. Germicidal effect of glutaraldehyde and quaternary ammonium salt compound solution and its influencing factors [J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2010,46 (7):58-60.
[10] 李东力,刘希真,陈春田,等. 二氧化氯对不同载体污染菌的杀灭效果[J]. 中国消毒学杂志, 2003, 20 (1): 44-45.
Li D L, Liu X Z, Chen C T,etal. Efficacy of chlorine dioxide in killing contaminating bacteria on different carriers [J]. Chinese Journal of Disinfection, 2003, 20 (1): 44-45.
[11] 张 珍,高富红,潘贵珍,等. 戊二醛苯扎溴铵溶液对载体的消毒试验[J]. 畜牧与兽医, 2016,48 (9):125-127.
Zhang Z, Gao F H, Pan G Z,etal. The germicidal efficacy of glutaraldehyde and benzalkonium bromide solution on carriers [J]. Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2016,48 (9):125-127.