不同方法测定芦丁片中芦丁含量的比较*

高召军 齐永秀

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

芦丁(Rutin)，别名：芸香苷，是一种从植物中提取的黄酮类化合物，其具有很多方面的生理活性，具有抗紫外线、抗血栓形成、维持血管弹性、增强毛细血管抵抗力的能力，并有降低血管脆性和通透性及对癌症的辅助治疗等作用[1-2]。正因为芦丁有如此好的医学作用，富含芦丁的植物，如槐米、苦荞麦，可作为保健品使用。此外，芦丁还能作为抗氧化剂和天然食用色素[3]。目前文献报道芦丁片的含量测定方法有HPLC法和UV法，本研究采用HPLC法和UV法分别测定芦丁片中的芦丁含量，并用F检验的方法对这两种方法进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料

Waters e2695型高效液相色谱仪；KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；岛津UV-2700型紫外分光光度计；FR224CN型电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)。芦丁标准品(上海融禾医药科技有限公司，批号：130729，纯度>99%)；芦丁片(规格：20 mg×100片，批号：C150601，山西云鹏制药有限公司)；甲醇(色谱纯)。

1.2 方法

1.2.1紫外-可见分光光度法测定

1.2.1.1对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10 mg,置50 ml容量瓶中，用75%的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀得浓度为200 μg/ml的标准溶液，避光冷保存。

1.2.1.2供试品溶液的制备 取样品10片，平均片重0.0671 g，研细，精密称取0.0671 g(相当于芦丁20 mg)置于100 ml容量瓶中，加入70 ml75%乙醇到容量瓶中，超声处理，用75%的乙醇稀释至刻度，摇匀取5 ml的溶液，置于50 ml容量瓶中，75%的乙醇稀释至刻度，摇匀即得。

1.2.1.3测定波长的选择 量取芦丁对照品溶液，用75%的乙醇水作为空白对照，用紫外分光光度计在400～600 nm的波长范围内进行扫描，结果在波长500 nm处有最大吸收，故确定检测波长为500nm。

1.2.1.4线性关系 精密量取芦丁对照品溶液0.25 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml和5.0 ml，置10 ml的容量瓶中，加入75%的乙醇至5ml，加5%的亚硝酸钠溶液0.30 ml，摇匀静置6min；加10%的硝酸铝溶液0.30 ml，摇匀静置6min；加4%的氢氧化钠4.0 ml，用75%乙醇溶液定容到刻度，摇匀静置15 min。以相应试剂为空白，用紫外分光光度法在500 nm波长处测各个标准品的吸光度，得回归方程为：Y=0.0115X+0.0011，r=0.9990，芦丁浓度在5～100 μg/ml范围内线性关系良好。

1.2.1.5精密度实试验 精密量取上述对照品溶液，按“1.2.1.4”项下方法测定，计算芦丁吸光度值的RSD为0.317%，表明该方法精密度良好。

1.2.1.6溶液稳定性试验 取供试品溶液2 ml，按“1.2.1.4”项下方法配成40 μg/ml的供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h进行测定，计算RSD为0.405%，表明样品溶液在12 h内稳定。

1.2.1.7加样回收率试验 取同批已知浓度的供试品溶液(浓度100 μg/ml)9份，按80%、100%、120%加入芦丁对照品溶液，各3份，按“1.2.1.4”项下方法测定，计算回收率，平均回收率为99.36%，RSD为1.25%。

1.2.2高效液相色谱法测定

1.2.2.1色谱条件 色谱柱为Venusil MP C18(5μm,4.6 mm×250 mm)；流动相为甲醇-0.2%冰醋酸溶液(40∶60)，用0. 45 μm的滤膜抽滤，超声脱气；检测波长254 nm，流速为1.0 ml/min，进样量20μl，温度30 ℃。

1.2.2.2对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10 mg，置50 ml容量瓶中，用75%的乙醇溶解并稀释至刻度，晃匀，得浓度为200 μg/ml的标准溶液，避光冷保存。

1.2.2.3样品溶液的制备 取样品10片，研细，精密称取0.0671 g(相当于芦丁20 mg)置100 ml容量瓶中，加入70 ml75%乙醇，超声处理，稀释至刻度，摇匀。量取5 ml，置50 ml容量瓶中，稀释至刻度即得。

1.2.2.4阴性样品溶液制备 按处方工艺制备不含芦丁成分的片剂阴性样品，按照“1.2.2.3”项下方法操作，即得。

1.2.2.5系统适应性实验 取对照品溶液(200 μg/ml)，样品溶液、阴性对照溶液在上述色谱条件下进样20 μl，记录色谱图。供试品与对照品相同的保留时间有相同的色谱峰，而空白溶液无干扰。所得谱图如图1。

图1 色谱图(S1阴性对照溶液；S2芦丁标准品；S3样品溶液)

1.2.2.6线性关系 精密量取芦丁对照品溶液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml和5.0 ml，置10 ml的容量瓶中，用75%的乙醇溶液稀释成20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml和100 μg/ml的溶液，在254 nm波长处进样20 μl，测定，以芦丁浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，得回归方程：Y=30298X-88982,r=0.9996结果表明，在20～100 μg/ml的浓度范围内线性关系良好。

1.2.2.7精密度试验 精密量取标准品1 ml置10 ml容量瓶中，配成20 μg/ml的标准品溶液。按“1.2.2.1”色谱条件，进样20 μl，重复进样5次，计算芦丁峰面积RSD为0.088%，表明该方法精密度良好。

1.2.2.8稳定性试验 取供试品溶液稀释成40 μg/ml，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h进行测定，计算RSD为0.096%，表明样品溶液在12 h内稳定。

1.2.2.9加样回收率试验 取同批已知浓度的供试品溶液(芦丁浓度100 μg/ml)9份，按80%、100%、120%加入芦丁对照品溶液，各3份，用75%的乙醇稀释至刻度，摇匀。在“2.2.1”色谱条件下，进样20 μl，计算回收率，平均回收率为100.11%，RSD为1.58%。

2 结 果

2.1 样品测定

取3个不同批次的芦丁片按上述方法制备供试品溶液，取供试品溶液2.5 ml，置25 ml容量瓶中，加75%乙醇稀释至刻度。在500 nm处测定其吸光度，将吸光度带入回归方程，计算得供试品中芦丁的平均含量为19.75 mg。

2.2 样品测定

取同样3个不同批次的芦丁片按上述方法制备成供试品溶液，取供试品溶液2 ml，置10 ml容量瓶中，加75%乙醇稀释至刻度。在“1.2.2.1”色谱条件下，进样量为20 μl注入液相色谱仪，在254 nm处测定其峰面积，以标准曲线计算样品中芦丁的平均含量为19.56 mg。

2.3 不同检测方法测得芦丁含量的比较

根据高效液相色谱法和紫外分光光度法测定芦丁片中的芦丁含量，比较高效液相色谱法和紫外分光光度法两种检验方法测得同种样品中芦丁的含量。结果见表1。

表1 不同方法检测的芦丁浓度结果

2.4 F检验

紫外分光光度法，共测5次，S1=0.057；高效液相色谱，共测4次，S2=0.054。f1=5-1=4;f2=4-1=3。查的F=9.12。F=S12/S22(S1>S2)，用实验测得标准差代入F的公式中，计算方差比：F=1.11。F

3 讨 论

本次实验研究确定了供试品溶液的制备方法，方法简便，重复性好，精密度、稳定性、加样回收率均能满足定量要求，所以两种方法均可用于芦丁片的含量测定。而采用 HPLC法测定芦丁片含量虽然准确，但是操作较为费时，UV法测定芦丁片中的芦丁含量其方法操作简便、容易掌握、节省时间，有利于在药品生产中进行快速分析，因此,UV法更显优势。

[1] Kreft I，Fabjan N,Yasumoto K.Rutin content in buckwheat(Fagopyrum esculentum Moench)food materials and products[J].Food Chemisty,2006,98:508-512.

[2] Metha R G,Murillo G,Naithani R,et al.Cancer chemoprevention by natural products:how far have we come[J]．PharmRes,2010,12:950-961.

[3] 杨云.芸香苷天然食用黄色素的改行研究[J].食品科学,1992,8：6-8.

[4] 陈运中.苦荞麦黄酮含量的测定[J].食品科学,1998,19(3):54-56.

[5] 何西利，富清，赵贵兰，等.芦丁-黄芩苷防晒霜的研制及性能评价[J].西北药学杂志,1998,13(6):257-258.

[6] 印嘉骏.苓芦凝胶防晒霜的制备及药效学研究[J].日用化学工业,1997，5:16-17

[7] 陈松林，魏秀莉.苦荞芦丁的提取及在护肤品中的应用[J].日用化学工业,1995，2:50-51

[8] 孙国禄，赵强，董晓宁，等.槐花化学成分及药理作用研究[J].中兽医医药杂志，2009，6：24-27.

[9] 江苏新医学院.中药大辞典(附编)[M].上海：上海科技技术出版社，1979：535.

[10] 江纪武，肖庆祥.植物药有效成分手册[M].北京：人民卫生出版社，1986：902.