泰山白首乌、赤首乌及市售何首乌中游离大黄素和大黄素甲醚的比较研究*

何文彬 李 飞 刘 克 吴超男 刘 佳 李玉琴

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

何首乌(Polygonum multiflorum) 属多年生缠绕藤本植物，以根入药。临床上何首乌有生首乌与制首乌之分：生首乌功能解毒(截疟)、润肠通便、消痈；制首乌功能补益精血、乌须发、强筋骨、补肝肾[1]。目前已经研究得到何首乌中的主要成分有大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸等蒽醌类及芪类成分。蒽醌类化合物具有调血脂、抗菌、强心、抗癌、心肌损伤保护、润肠通便的作用[2-4]。目前市面上有多种何首乌，质量参差不一，因此很有必要对不同种何首乌中蒽醌类化合物的含量进行测定。本实验采用高效液相色谱法测定白首乌、赤首乌以及市售何首乌大黄素、大黄素甲醚的含量，该方法简便，准确，灵敏度高，重现性好。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公公司)、UV200紫外可变波长检测器(大连依利特分析仪器有限公司)、水浴锅(北京长风仪器仪表公司)、FA2004N型电子天平(上海民析精密科学仪器公司)、TG-16G高速离心机(盐城凯特实验仪器有限公司)、粉碎机(青州市精诚医药装备制造有限公司)、KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

大黄素甲醚对照品(成都普思生物科技股份有限公司，批号PS0291-0020)、大黄素对照品(中国药品生物制品检定所，批号110756-200110)色谱纯甲醇(山东禹王实业有限公司化工分公司)、分析纯磷酸(莱阳市康德化工有限公司)、分析纯氯仿、娃哈哈纯水。泰山白首乌、赤首乌均采自泰山医学院药用植物园(经刘克老师鉴定)，自然晾干，备用。市售何首乌购自泰安市药材市场。

1.3 对照品溶液制备

精密称取大黄素对照品适量，用甲醇配制成1.0 mg/ml的储备液，备用。1.0 mg/ml大黄素甲醚对照品溶液配制方法同上。

1.4 供试品溶液制备

取自然晾干的白首乌根样品粉碎，精密称取10 g，置于50 ml具塞锥形瓶中，加30 ml氯仿，超声提取90 min，放冷，抽滤。取续滤液置于烧杯中，于70 ℃水浴中挥干溶剂，加甲醇定容到10 ml。进样前用微孔滤膜过滤。赤首乌、市售何首乌处理方法同上。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：大连依利特SinochomODS-BP色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；柱温：室温；流动相：甲醇-0.1%磷酸(90︰10)；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；进样量：20μl。 在此色谱条件下，对照品色谱图见图1，色谱峰与相邻峰达到基线分离。

图1 对照品色谱图(1-大黄素，2-大黄素甲醚)

2.2 线性关系的考察

取“1.3”项下制备的对照品溶液，按1.0 μg/ml、2.5 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、25.0 μg/ml浓度梯度配制混合对照品溶液。精密量取各混合对照品溶液20μl，按“2.1”项下的色谱条件测定，以浓度X(μg/ml)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 大黄素、大黄素甲醚的回归方程、相关系数及线性范围

2.3 精密度实验

取2.5 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml低、中、高三个浓度的混合对照品溶液，于1 d内连续进样3次，连续测定3 d，记录峰面积，计算日间和日内峰面积的RSD，结果见表2。由表2可见，RSD均<2.0%，说明方法和仪器精密度良好。

表2 精密度实验结果

2.4 样品测定

取“1.4项”下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定(图2A、B)，每样品平均进样3次，记录峰面积，以3次进样的均值为结果，计算白首乌、赤首乌以及市售何首乌的根中大黄素、大黄素甲醚成分的含量。供试品的测定结果见表3。由表3可知，市售何首乌中大黄素的含量约为泰山赤首乌的2.5倍；大黄素甲醚的含量接近；而白首乌中大黄素和大黄素甲醚均未检测到。

图2 样品色谱图(1-大黄素，2-大黄素甲醚)

赤首乌白首乌市售何首乌大黄素(μg/g)35.49未检出88.03大黄素甲醚(μg/g)35.21未检出33.43

2.5 加样回收率实验

采用加样回收的方法考察方法的准确度。等体积精密量取已准确测定含量的何首乌根部提取液9份，3份一组，每组分别加入高、中、低浓度的混合对照品溶液，用甲醇定容至刻度，摇匀。在“2.1”项色谱条件下，每份重复进样3次，记录峰面积，并计算回收率，结果见表4。由表4的可知，该试验的回收率较高，表明实验方法准确、可行。

表4 回收率实验结果

3 讨 论

3.1 提取方法考察

根据大黄素和大黄素甲醚的溶解性，分别用氯仿和甲醇采用回流的方法提取，并在上述色谱条件下进行测定。以赤首乌的甲醇提取液色谱图为例，由图3可见，甲醇提取率低，直接进样测定基线不稳定，可能是由于大黄素和大黄素甲醚在甲醇中溶解度较低造成的。由于氯仿更容易渗入中药材组织,且大黄素和大黄素甲醚在氯仿中溶解度较高，所以为提高提取的效率，本实验选择氯仿回流提取。

图3 甲醇提取液色谱图

3.2 流动相的选择与优化

3.2.1流动相磷酸的浓度 在HPLC法中，影响柱效、分离度和分析时间的因素主要是流动相。本实验中采用的流动相为甲醇-0.1%磷酸。在相同的实验条件下，考察了磷酸浓度分别为0.05%、0.1%、0.15%时对柱效、分离度和分析时间的影响，结果见图4。由图4可知，随着磷酸浓度的升高，出峰时间缩短，峰型无太大变化，但由于酸性太高可能对样品中有效成分有一定的影响，故本实验采用的磷酸浓度为0.1%。

图4 不同磷酸浓度的色谱图

3.2.2流动相比例 在HPLC法中，流动相比例的变化也会对柱效、分离度和分析时间产生一定的影响。本实验考察了甲醇和0.1%磷酸比例的影响，结果见图5。由图5可知，随着0.1%磷酸比例的降低，出峰时间延长，峰形变宽，柱效降低，但甲醇比例太高时样品峰与杂质峰得不到很好的分离，因此，选择用90︰10甲醇-0.1%磷酸为流动相。

图5 流动相优化

本实验采用了高效液相色谱法测定何首乌中游离大黄素和大黄素甲醚的含量，建立了一系列的测定方法。该方法操作简单，测量准确。经测定发现，不同何首乌中蒽醌类成分的含量不同。在泰山赤首乌以及市售何首乌的根中均检出大黄素和大黄素甲醚，而泰山白首乌中未检出。该结果可为合理使用何首乌提供理论指导。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典,2005版一部[S].北京:化学工业出版社,2005:122 -123,187.

[2] Lin LF, Boran N, Lin HM, et al. Simultaneous determination and pharmacokinetic study of P-hydroxybenzaldehyde,2,3,5,40-tetrahydroxystilbene-2-O-β-glucoside, emodin-8-O-β-D-glucop-Yranoside, and emodin in rat plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry after oral administration of Polygonum multiflorum[J]. Anal Meth,2015,7:244-252.

[3] Zhu ZW, Li J, Gao XM, et al. Simultaneous determination of stibenes, phenolic acid, flavonoids and anthraquinones in radix polygoni multiflori by LC-MS/MS[J].Pharma Biom Anal,2012,62:162-166.

[4] He DX, Chen B, Tian QQ, et al. Simultaneous determination of five anthraquinones in medicinal plants and pharmaceutical preparations by HPLC with fluorescence detection[J].Pharm Biom Anal,2009,49:1123-1127.