不同炮制方法对大枣中环磷酸腺苷含量的影响

刘世军，王 林，唐志书*，宋忠兴，崔春利，刘红波，梁艳妮，张 娱，许洪波，史鑫波，雷甜甜

(1.陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712083；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083；3.陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西 咸阳 712083）

大枣是鼠李科灌木植物枣（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果实。大枣甘、温。归脾、胃经，具有补中益气、养血安神的功效[1]。十枣汤用大枣10枚煎汤送服，取其益脾缓中，防止逐水伤及脾胃，并缓和诸药毒性[2-3]。小建中汤用大枣补脾而缓急止痛[4]。《本草纲目》记载将其作为丸剂的辅料使用[5]，张仲景的一些方剂[6]以及现在治疗失眠的许多处方都有大枣[7-9]。大枣中含有丰富的环磷酸腺苷[10]。环磷酸腺苷为参与调节细胞功能的第二信使物质，其作用非常广泛。经常食用大枣可以增加人体白血球内环磷酸腺苷的作用，具有良好的镇静、催眠和降压的作用[11]，还能有效减轻化学药物在人体的堆积对肝脏的损伤；可以增加人体免疫细胞内环磷酸腺苷的含量，从而抑制人体在受到外界刺激时所产生的免疫反应，降低过敏反应的发生[12]。本实验通过醋炙、酒炙、醋蒸、酒蒸、三蒸三制、炒焦等炮制方法对大枣进行炮制后，采用高效液相色谱法测定炮制前后样品中环磷酸腺苷的含量。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪、2998型紫外检测器（美国Waters公司）；高效液相色谱柱为Agilent TCC18（250×4.6 mm，5 μm）；高速万能粉碎机（天津鑫博得仪器有限公司）；101型电热鼓风烘箱（北京科伟永兴实验有限公司）；KQ-300DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TG328B型分析天平（上海天平仪器厂）；溶剂过滤器（天津市津腾实验设备有限公司）；中国药典标准药筛二号筛（浙江省上虞市大亨桥化验仪器厂）。环磷酸腺苷对照品（批号为16082301），购于陕西乐博生化科技有限公司；甲醇（迈瑞尔上海实验设备有限公司），为色谱纯；磷酸二氢钾（天津市盛奥化学试剂有限公司），为分析纯；水为超纯水；大枣购于陕西合阳；陈醋（岐山天缘食品有限公司）；白酒（北京二锅头酒业股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 大枣炮制品的炮制方法

2.1.1 大枣生品 取同一批次的大枣抢水洗干净，烘干，用时剖开。

2.1.2 醋蒸大枣[13]取洁净大枣适量，剖开，加入20%的陈醋浸润，待醋被吸收完全后，放入蒸锅内蒸至颜色呈暗红色，取出放凉，干燥。

2.1.3 醋炙大枣[13]取洁净大枣适量，剖开，加入20%的陈醋浸润，待醋被吸收完全，文火炒干并至表面微黄色，香味溢出。

2.1.4 酒蒸大枣 取大枣适量，剖开，加入10%的酒将大枣浸润，蒸制0.5 h放凉，取出，干燥。

2.1.5 三蒸三制 取洁净大枣适量，至锅内隔水蒸制0.5 h，取出放凉，重复3次，取出，干燥即可。

2.1.6 酒炙大枣 取大枣适量，剖开，加入10%的酒将大枣浸润，文火炒至香味溢出。

2.1.7 炒焦大枣[14]将适量大枣取出剖开，置锅内于武火炒至外表皮破裂，表面有焦斑。

2.2 大枣的预处理 将炮制后的大枣和生品干燥后用粉碎机粉碎，分别过二号筛，装于密封袋中，在避光干燥处保存。

2.3 大枣中环磷酸腺苷含量的测定方法

2.3.1 色谱条件的选择 高效液相色谱柱为Agilent TCC18（250×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.03 mol/L K2HPO3（A）-甲醇（B）溶液；梯度洗脱，梯度洗脱程序为0～25 min时10%（A）:90%（B），25～30 min时10%～50%（A）:90%～50%（B），30～40 min时50%（A）:50%（B），40～50 min时，10%（A）～90%（B）。流速为1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL[15]。

2.3.2 色谱峰的确定 取配制好的并且已经过了0.45 μm微孔滤膜的环磷酸腺苷标准品溶液适量，在已经设置好的拟定色谱条件下进样10 μL，通过对照标准品出峰的时间和位置来分析样品中环磷酸腺苷的出峰位置。见图1。

图 1 环磷酸腺苷对照品的高效液相色谱图

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称定环磷酸腺苷对照品5.1 mg，置于50 mL容量瓶中，加入超纯水溶解至刻度，制成混合对照液。再吸取对照品溶液4.9、2.45、1.225、0.613、0.306 mL，分别置于10 mL的容量瓶中，加超纯水稀释并定容至刻度线，配制成浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125 mg/L的标准对照品溶液，用时再经过0.45 μm的微孔滤膜过滤。

2.3.4 供试品溶液的制备 精密称取炮制好的大枣粉末各1 g，置于100 mL的锥形瓶中，加入超纯水20 mL，称定质量，超声提取40 min，冷却，再称重并补足减失的质量，摇匀，滤过，然后转移到容量瓶中定容至25 mL，经过0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液[20]。

2.4 线性关系考察 取已制备好的不同浓度的标准品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，测定其所对应的峰面积。以溶液浓度为横坐标，测得的峰面积为纵坐标，绘制大枣环磷酸腺苷标准曲线。得出的标准曲线回归方程为：Y = 21 342X+7 175.8，R2= 0.999 2（n = 5）。从结果中可以得出环磷酸腺苷含量在0.031 25～0.5 μg的范围内与峰面积的线性关系良好。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密量取浓度为12.5 mg/L的环磷酸腺苷对照品溶液，在相同的色谱条件下注入高效液相色谱仪，每次10 μL，重复进样6次。测定环磷酸腺苷的峰面积RSD为1.73%（n = 6），表明仪器的精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 精密称取已炮制处理好的醋炙后的大枣粉末1 g，按照2.3.4下的制备方法来制得1份供试品溶液，并放于室温下密闭保存。取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h下，于相同色谱条件中分别进样10 μL，测定醋炙大枣中的环磷酸腺苷峰面积的RSD为1.74%，表明在12 h内炮制大枣供试品溶液在室温下稳定性良好。

2.5.3 重复性实验 精密称取同一批酒炙的样品，按照2.3.4下的方法制备6份供试品溶液，在相同色谱条件下进样，进样量为10 μL，然后分别测量环磷酸腺苷的面积并计算其含量。结果得出样品中环磷酸腺苷含量的RSD为0.5% ，表明应用的方法重复性良好。

2.5.4 加样回收实验 量取已知含量的同一炮制品粉末0.5 g，共称取5份，精密称定，置于锥形瓶中。再分别加入已配置好的浓度为102 mg/L的环磷酸腺苷对照品溶液1.5 mL，然后按照样品溶液配制方法配制成供试品溶液，在同一色谱条件下分别进样10 μL，测定环磷酸腺苷的峰面积并计算加样回收率，平均回收率98.29%，RSD 0.74%。

2.6 样品的含量测定 分别取已配制好的大枣生品和醋炙、酒炙、醋蒸、酒蒸、三蒸三制、炒焦的大枣炮制品供试品溶液各10 μL，在相同拟设定的色谱条件下注入高效液相色谱仪，测定大枣中环磷酸腺苷的峰面积，并按照所求得的线性回归方程计算大枣中环磷酸腺苷的含量。见表1。

表1 不同炮制方法下大枣中环磷酸腺苷的含量

3 讨论

经与未经炮制的大枣生品比较发现，经过炮制的大枣中环磷酸腺苷含量均有提高，其中经过醋蒸的大枣环磷酸腺苷含量增加最为明显。炮制后的环磷酸腺苷含量增加的原因可能是因为环磷酸腺苷为水溶性物质，能与醋酒结合，而且经过蒸制后，蒸汽里的水分进大枣内部，使环磷酸腺苷有效溶出，增加了含量。在炒焦时，由于大枣表皮结构紧密，经过武火炒炙，其表皮遭到破坏后破裂，使得大枣内部受热面积增大，更容易让其有效成分受热溢出。本次实验结果表明，运用高效液相色谱法检测炮制大枣中环磷酸腺苷的含量，精密度高、操作简单、可以重复检测。

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