补肾活血中药对薄型子宫内膜大鼠子宫内膜干细胞标志物的影响

尹晓丹，王景尚，何军琴，薛晓鸥

（1.首都医科大学附属北京妇产医院，北京 100026；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

薄型子宫内膜是指子宫内膜厚度低于能够获得妊娠的阈厚度，即小于7 mm[1]。近年来研究表明，子宫内膜中存在子宫内膜干细胞，其是一类可以促进子宫内膜再生的细胞[2-4]，是具有自我更新以及增殖能力的细胞。随着研究不断深入，有学者认为，子宫内膜干细胞有可能成为治疗薄型子宫内膜的手段[5]。目前研究发现，Wnt/β-catenin信号通路是一个保守的细胞信号系统，在胚胎发育、维持器官及组织稳态方面，发挥了至关重要的作用，并且与薄型子宫内膜的发病机制相关，该通路激活后使β-catenin在细胞质内积聚，是Wnt的活性调控信号通路的关键[6]。多项研究亦表明，Oct4、ABCG2是胚胎干细胞的重要标记物[7-8]。因此，β-catenin、Oct4、ABCG2虽然并非子宫内膜干细胞特有，但能够反映子宫内膜干细胞的特性。

1 材料和方法

1.1 动物 SPF级SD大鼠，雌性，200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（京）2012-0001。动物适应3天环境，自由饮水饮食，室温（22±1）℃，湿度（40±10）%，光照周期12/12 h。

1.2 药品 实验用中药材，购自同仁堂药店。补肾活血方由熟地15 g，菟丝子12 g，桑寄生12 g，覆盆子12 g，续断12 g，川牛膝12 g，当归12 g，丹参12 g，泽兰12 g，川芎9 g，益母草20 g，鸡血藤12 g，红花9 g组成，按人鼠体表面积换算，大鼠剂量为人的等效剂量。戊酸雌二醇，1 mg/片，拜耳公司，批号：J20130009，按人鼠体表面积换算，大鼠计量为0.3 mg/（kg·d），羟基脲，齐鲁制药有限公司，批号H37021289，按人鼠体表面积换算，大鼠计量为450 mg/（kg·d），高分子右旋糖苷，Dextran70，瑞士Amwesham Biosciences公司，按人鼠体表面积换算，大鼠计量为5 mL/kg。

1.3 主要试剂 β-catenin一抗、ABCG2一抗（购自Abcam公司），生物素标记的山羊抗兔IgG、辣根酶标记链霉卵白素、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒（均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。

1.4 动物分组及用药 将大鼠随机分为6组，每组6只：正常对照组，灌服蒸馏水；模型组，肾虚血瘀薄型子宫内膜模型建立后，灌服蒸馏水；补佳乐模型组，模型组基础上，灌服补佳乐0.3 mg/（kg·d）；补肾活血高剂量组，模型组基础上，灌服补肾活血中药8.64 mg/kg；补肾活血中剂量组，模型组基础上，灌服补肾活血中药4.32 mg/kg；补肾活血低剂量组，模型组基础上，灌服补肾活血中药2.16 mg/kg。

1.5 动物模型制备 肾虚血瘀模型：参照林继红，杨海英等《实验动物学》建立肾虚血瘀型大鼠模型。大鼠采用羟基脲450 mg/（kg·d）给大鼠灌胃，于实验末次给药30 min后尾静脉快速推注10%高分子右旋糖苷5 mL/kg。给羟基脲8 d后，发现大鼠皮毛枯槁欠光泽，体型瘦小等肾虚症状；注射高分子右旋糖苷后观察发现大鼠耳、爪、尾部颜色紫暗，提示有血瘀，从而造成肾虚血瘀模型。将肾虚血瘀模型大鼠腹部切开皮肤进入腹腔，定位子宫后，在宫角处注入0.3 mL95%无水乙醇，保持宫腔充盈状态，2 min后再次注药，重复此操作，另一侧操作相同，反复冲洗宫腔，关腹。最终造成肾虚血瘀薄型子宫内膜模型。

1.6 实验方法

1.6.1 免疫组织化学检测活化β-catenin蛋白 将标本固定于4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，连续切片。免疫化学染色采用SABC法，用PBS代替一抗作阴性对照。将切片滴加正常山羊血清。滴加活性β-catenin抗体（浓度1:300），置于4 ℃冰箱过夜。苏木素复染，盐酸乙醇分化、脱水、封片。每张切片在子宫内膜层随机选取5个视野拍照，应用Image-Pro Plus6.0图像分析软件系统，计算每组标本切片中平均光密度值（IOD）。

1.6.2 RT-PRC检测Oct4基因表达 采用RNA提取试剂盒，提取子宫内膜干细胞总RNA。逆转录采用Quant逆转录酶，在37 ℃1 h反映条件下，逆转录。实时定量PCR检测Oct4在子宫内膜干细胞中基因表达情况。

1.6.3 Wertern blot法检测ABCG2蛋白的表达 首先提取总蛋白，BCA方法检测蛋白浓度，按照湿法电转印方法操作，最后用ECL化学发光法显色，以Tubulin作为对照。

1.7 统计学方法 数据以均数±标准差（x± s ）表示，运用SPSS 18.0统计软件，进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 补肾活血中药对薄型子宫内膜大鼠活化β-catenin蛋白影响 模型组较对照组极显著降低（P＜0.001）；给药后各组β-catenin不同程度增加；低剂量组较模型组有显著性差异（P＜0.05）；中剂量组，高剂量组，补佳乐组与模型组有极显著性差异（P＜0.001），见表1、图1。

2.2 补肾活血中药对薄型子宫内膜大鼠活化Oct基因影响 模型组较对照组极显著降低（P＜0.001）；给药后各组OCT4表达量不同程度增加；其中低剂量、中剂量与模型组无显著性差异；高剂量与模型组有极显著性差异（P＜0.001）；补佳乐组与模型组有显著性差异（P＜0.05），见表2。

表1 补肾活血中药对薄型子宫内膜大鼠活化β-catenin蛋白影响

图1 各组薄型子宫内膜大鼠活化β-catenin蛋白，X100

表2 补肾活血中药对薄型子宫内膜大鼠OCT4mRNA表达量的影响

2.3 补肾活血中药对薄型子宫内膜大鼠ABCG2蛋白影响 见表3、图3。

表3 补肾活血中药对薄型子宫内膜大鼠ABCG2蛋白表达量的影响

图3 各组薄型子宫内膜大鼠ABCG2蛋白检测

3 讨论

早在1978年，Prianishnikov[9]就提出子宫内膜干细胞的假设，并认为子宫内膜干细胞可修复子宫内膜。然而，子宫内膜在修复过程中易受到不良因素影响从而导致薄型子宫内膜等内膜疾病[10]，这类疾病可能与子宫内膜干细胞不足有关[11]。目前，已有大量的临床基础研究发现，补肾活血类中药能改善子宫内膜环境，增加子宫内膜的容受性[12-15]。补肾活血中药不仅对子宫内膜疾病有治疗作用，而且有学者将补肾活血大法用于治疗其他妇科疾病也有较好的疗效[16-18]。本实验发现补肾活血中药可以增加子宫内膜干细胞相关标记物OCT4基因、ABCG2蛋白的表达，由此推测补肾活血中药可能是通过增加子宫内膜干细胞的表达来治疗薄型子宫内膜的[19-20]。实验还发现补肾活血中药作用后活化β-catenin蛋白的表达增加，而β-catenin是经典Wnt/β-catenin通路调控的关键，因此，我们推测补肾活血中药是不是通过对Wnt/β-catenin信号通路的调节而干预了子宫内膜干细胞的表达，这种推测将在进一步的体外实验中进行探讨。

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