ASAP1基因影响结核易感性的研究进展

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结核病(Tuberculosis，TB)是目前严重威胁人类健康的慢性传染性疾病之一，主要由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)致病。大量研究表明, 人群暴露于结核分枝杆菌通常只有 1/3 会受到感染，其中约10% 感染者发展为不同程度的临床结核病[1]。这间接说明，结核分枝杆菌仅仅是致病因素的一方面，由于其与宿主之间复杂的免疫学相互作用，结核病的易感程度还与个体的遗传背景有关系，因此，摒弃宿主的易感决定基因而单纯地研究结核分枝杆菌的致病性是片面的，菌体与宿主之间的免疫互作将得不到系统的阐述[2]。近年来，随着全基因组测序和关联性分析的飞速发展，人类多个结核病易感基因相继被发现，主要有人类白细胞抗原(HLA)基因、自然抗性相关巨噬细胞蛋白 1(NRAMP 1)基因、维生素D受体 (VDR) 基因等[3]。本文综述的ASAP1作为新发现的结核易感基因，首先由剑桥大学研究者通过GWAS(Genome-Wide Association Study)发现[4]，之后国内外研究者在不同地区、种族人群中进行了ASAP1关联性研究及连锁分析，对ASAP1的功能和影响结核易感的机制作出了初步探究，为全面揭示结核易感性的遗传差异机制奠定了方法学基础且提供了理论指导。

1 ASAP1基因

ASAP1(ADP ribosylation factor-GTPase activating protein)基因位于人类第8号染色体(8q24)，编码蛋白约130 kD[5]，蛋白一级结构如图1所示。ASAP1是ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors，Arf)的GTP酶激活蛋白。Arf家族蛋白分子量约20 kDa，属于小G蛋白，在真核生物中广泛存在且进化上高度保守，主要参与膜泡转运和细胞骨架的调节[6-7]。Arf在细胞中有两种结合状态，与 GTP结合为活性状态，与GDP结合为非活性状态，鸟苷交换因子 (Guanine nucleotide-exchange factor，GEF)和GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein，GAP)调控其在两种结合状态之间转换。ASAP1属于调控Arf的 GAP 蛋白，也称为AMAP1或centaurinβ，是Arf的负调因子，识别Arf·GTP后诱导GTP水解形成Arf·GDP，使Arf功能失活。报道显示[8]：当细胞发生内吞过程时，Arf应处于活性状态，即Arf·GTP。首先将包被蛋白募集在膜上，内吞囊泡形成后向相应的亚细胞器转运，当到达亚细胞器膜之前，Arf失活即Arf·GDP促进囊泡膜上的包被蛋白解离，进而成功与亚细胞器膜融合。也就是说，Arf的失活也即ASAP1等GAP 蛋白作用的Arf是囊泡与目的亚细胞器融合的必要条件。

图1 ASAP1蛋白示意图[6,9]Fig.1 Schematic diagram of ASAP1 protein[6,9]

2 ASAP1 功能及其影响人类结核易感性的机制

关于ASAP1功能主要集中在与细胞内吞、细胞内膜泡转运与细胞骨架的运动调控方面，还与肿瘤的转移和扩散有关[10]。Haque[11]利用iRNA使ASAP1基因沉默来探究LPS诱导的RAW 264.7类巨噬细胞炎症反应中ASAP1的作用，最终发现，ASAP1的沉默增强了细胞因子TNF-α、IL-6、IFN-β与NO的表达，且对NF-κB的下游信号通路起负调控作用。Tien[12]等也相应发现ASAP1对细胞内调节炎症反应的转录因子NF-kB的信号通路起负向反馈调控作用，揭示ASAP1可能成为治疗炎症反应的新靶点。Ruggiero[13]发现一个定位于高尔基体的复合物KDELR 通过增加足突这种细胞结构发挥降解胞外基质的功能，而足突功能的发挥是依赖与KDELR对ASAP1的磷酸化实现的，间接反应出ASAP1对于胞外基质的降解是必须的。Davidso[14-15]等发现一种依赖于Arf 6 的细胞肌动蛋白重组机制能增强沙门菌的侵染，并且指出Arf GEFs 与Arf GAPs 的平衡关系也即Arf·GTP和Arf·GDP的循环有利于宿主细胞对沙门菌的吞噬。在NIH3T3小鼠成纤维细胞中，ASAP1蛋白的定位与黏着斑、环形背褶和足突相一致，与胞外基质的降解有一定联系[16]。

目前针对ASAP1蛋白影响人类结核易感性的机制问题的研究尚处于探索阶段，现主要集中在ASAP1蛋白表达对于免疫细胞迁徙能力的调控，进而影响人类对于TB的易感性。机体感染Mtb后，固有免疫细胞和适应性免疫细胞与Mtb的相互作用是一个动态发展的过程[17]，其中巨噬细胞和树突状细胞发挥了举足轻重的作用[18]。Mtb主要通过呼吸系统侵入机体，激活单核-巨噬细胞系统，一部分Mtb被巨噬细胞吞噬杀灭，抗原提呈在细胞表面，进而激活T淋巴细胞引发细胞免疫反应，另一部分Mtb在细胞的吞噬小体中潜伏下来，与宿主免疫细胞形成一种特征性的组织病理结构，即结核性肉芽肿。2016年Berg[19]分析了溶酶体贮积症患者对Mtb的易感性问题，发现导致易感的根本原因为溶酶体贮积的巨噬细胞迁徙能力受到了抑制，不能及时对Mtb的感染作出清除吞噬反应，进而Mtb在溶酶体贮积症患者体内较之于健康的免疫系统人群更容易扩散。Curtis[4]通过qRT-PCR 检测感染Mtb的树突状细胞(dendritic cell, DC)中 ASAP1的mRNA表达量明显降低，且受感染的DC游走能力与吞噬溶酶体形成能力都有所降低。Roberts[20]结合流式细胞术与共聚焦显微技术发现了Mtb感染的树突状细胞表面表达的β2(CD18)整合素有明显的减少，αL(CD11a)和αM(CD11b)整合素亚基也相应的减少，并且展示感染后DC对肺内皮细胞层黏附能力下降以及对淋巴趋化因子的迁徙能力减弱，最终削弱了固有免疫细胞对抗原的提呈延迟适应性免疫的发生，使得Mtb在体内得到更广的扩散与分布。综合以上现阶段对于TB的易感机制探究和ASAP1蛋白的功能，推测ASAP1蛋白主要影响免疫细胞的迁徙能力，进而影响机体对于病原菌侵噬的免疫过程。

3 ASAP1基因与结核病易感性的相关研究报道

2015年Curtis[4]对来自世界TB高发区俄罗斯圣彼得堡的5 914份活动性TB患者和6 022份健康志愿者的全基因组关联分析(GWAS)发现ASAP1的11个SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)与TB易感性显著相关，且全部分布于内含子中，并且对其中7个显著相关的SNP做了进一步统计学分析，得出了4个关联性最强的SNP位点(rs10956514，rs1469288， rs2033059，rs4733781)。文章初步得出ASAP1影响宿主易感性的机制为其削弱了DC的游走和对胞外基质的降解，使固有免疫过程减缓，增强了胞内寄生菌的生存力与侵染性。

2016年国内研究者Hu[21]对1 115例西部汉族人群和914例西藏人群应用iMLDR方法对ASAP1的7个SNP位点分型，再结合Meta 分析进一步探究ASAP1与TB的相关性，数据比较得出ASAP1与TB易感性在中国人群中无明显相关性。Hu[21]的发现说明了人群异质性与种族遗传背景差异影响TB的易感性。同年国内研究者Miao[22]在355例新近肺结核感染的中国人群中和395例健康人群中使用TaqMan等位基因鉴别法对ASAP1的2个SNP位点(rs10956514 和rs11774633)进行分析，发现ASAP1与TB易感性在中国人群中无明显关联。这也再次说明了基因多态性与疾病的关系强调种族的差异。

综上所述，关于ASAP1基因与结核病易感性关联的研究报道尚处于初级阶段，根据现有的结论发现不同人群对结核病的易感程度是不相同的，这缘于①个体遗传背景的复杂性：人体本身是一个复杂的微生态系统，人群对结核的易感性并非只受单个基因的影响，且基因间还存在连锁不平衡现象，这些因素最终导致了个体遗传背景的复杂性，进而使得单纯研究某一基因对疾病的影响存在极大困难；②环境因素的影响：外界环境条件不仅影响了Mtb对人群的接触程度，如干燥的环境更利于Mtb的播散，更主要的是使得个体在长期适应不同的气候与地理环境的进化过程中造成了机体的异质性，致使不同人群抵抗病原菌的反应程度不同；③选取的样本差异：研究条件和研究方法的限制造成一定程度的结果差异[3]。总之，结核病的发生是遗传和环境多因素作用的结果。因此，研究基因对于结核病的易感性要充分考虑上述因素，保证实验结果的可靠性与科学性，相信随着生物信息学与细胞免疫生物学的深入发展，ASAP1基因影响结核病的易感程度与作用机理都将得到很好的阐释。

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