星点设计-多指标评价优化六味地黄丸制备工艺△

屈云萍，李菲，刘育强，杨斯斯，黄宁，姜国志

(1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.中药注射剂新药技术开发国家地方联合工程实验室，河北 石家庄 051430)

六味地黄丸是最著名的经典方剂之一，滋阴补肾，用于头晕耳鸣、腰膝酸软、遗精盗汗，临床应用范围极其广泛。近年来，不少学者对六味地黄丸进行了广泛而深入地研究，并取得了较大的进展，文献[1]统计分析了1995—2000年以来六味地黄丸的研究，共计544篇，但其中的制药工艺研究仅有7篇，占总文献量的1.29%，且六味地黄丸含量控制项中，丹皮酚的含量、丸芯溶散时限受干燥温度及干燥时间的影响较大[2]，同样的，软材的粘合性、成型性对压丸得率也有很大的影响。本文通过星点设计-效应面法多指标评价，对六味地黄丸制备工艺进行优化研究，旨在稳定产品质量。

星点设计[3-6](central composite design，CCD)广泛应用于处方优化和制剂工艺，星点设计与常用的正交设计、均匀设计法相比，具有非线性拟合的特点，其结果可采用集数学和统计学方法于一体的效应面法进行优化，实验精度高，预测值更接近真实值，试验次数少，CCD-RSM广泛应用于处方优化和制剂工艺，该实验设计法既能考察各自变量对因变量的影响及各自变量间交互作用，也能进行各自变量的最优化，建立数学模型并做出相应的三维因变量曲面图，对自变量与因变量的关系进行直观的量化分析，CCD-RSM可较好地描述依赖变量和非依赖变量之间的关系。该方法直观性、方便性及预测性均比正交和均匀设计优化更好。

1 材料与仪器

六味地黄浸膏、药粉(神威药业集团有限公司中药提取车间提供)；丹皮酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号110708-201407)；甲醇(色谱纯，天津康科德公司)，其余试剂(分析纯，市售)。

HC200C槽形混合机(浙江温州化工机械厂)；中药自动制丸机(黑龙江制药机械厂)；荸荠式打光锅(宝鸡制药机械厂)；热风循环烘箱(常州范群干燥设备有限公司)；BJ-Ⅱ型智能崩解仪；紫外可见分光光度计。

2 方法与结果

2.1 六味地黄丸制备工艺

牡丹皮用水蒸气蒸馏法提取挥发性成分；药渣与部分酒萸肉、熟地黄、茯苓、泽泻加水煎煮二次，每次2 h，煎液滤过，滤液合并，浓缩成稠膏；山药与剩余酒萸肉粉碎成细粉，过筛，混匀；与上述稠膏和牡丹皮挥发性成分混匀，制丸，干燥，打光，即得。

2.2 丹皮酚含量的测定

采用高效液相色谱法测定[7]。

2.3 质量评价指标

以水分、丹皮酚含量、溶散时限、外观质量分数为评价指标，采用单因素试验研究浸膏相对密度、润湿剂用量、干燥温度、干燥时间4个影响因素对六味地黄丸制备工艺的影响。

六味地黄丸为浓缩丸，为规避丸剂的粒径大小及重量对溶散时限的影响，本试验严格按规格控制在每8丸重1.44 g(每8丸相当于饮片3 g)，即每丸重0.18 g，且在试验阶段通过筛分、拣选出不符合粒径、丸重要求的丸子。

2.3.1 水分(Y1) 按水分测定法(通则0832第四法)测定[8]103。

2.3.2 丹皮酚含量(Y2) 按2.2项下方法测定。

2.3.3 溶散时限(Y3) 取六味地黄丸6丸，选择孔径约2.0 mm筛网的吊篮，照溶散时限检查法(通则0921)测定[8]118。

2.3.4 外观质量分数(Y4) 随机取不同条件制备的丸芯各50丸，分别对各组丸芯的外观进行评分，设定圆整度、硬度、色泽等3个外观评价指标，分别占45、25、30分，满分为100分，将各指标评分相加作为丸芯的外观得分。

以Y1，Y2，Y3，Y4的总评“归一值”(overall desirability，OD)为评价指标[9]，根据4个指标对丸芯质量影响的重要性，设定各自权重分别为40%、20%、30%、10%。

OD值=(Y1/Y1max)×40%+(Y2/Y2max)×20%+(1-Y3/Y3 min)×30%+(Y4/Y4max)×10%

(1)

式中Y3越小越好。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 浸膏相对密度的影响 处方中六味地黄浸膏的量占比较大，与药材原粉及其余物料混合搅拌制备软材后压丸，本试验分别考察4个不同相对密度的浸膏按照2.1的方法压制丸芯，考察软材的性状、压制成条性、丸重差异及丸芯成型，结果见表1。

结果表明：相对密度1.38、1.40时，软材黏性适中，压丸容易成条，丸重差异小且丸面光滑，成型较圆整，因此可以选用1.39为中线做进一步考察。

3.1.2 润湿剂的选择 制备软材时用到的润湿剂为纯化水和乙醇，两者以不同的比例进行配合，另外乙醇用量比例较大时，能很好的改善丸芯的溶散，但同时软材黏性就会降低，导致压丸不易，本试验考察以纯化水、乙醇为润湿剂，按2.1的方法制备丸芯，考察软材的性状、压制成条性、丸重差异及溶散时限，结果见表2。

表1 浸膏相对密度的影响

表2 润湿剂的选择

结果表明：纯化水∶乙醇为1∶2时，软材硬度适宜、黏性适中，压制易成条、条面光滑，丸重差异小，且溶散时限合格，因此选择纯化水∶乙醇为1∶2为润湿剂，后续做用量的进一步考察。

3.1.3 干燥温度的影响 用浸膏相对密度为1.39(30 ℃)、选择润湿剂为纯化水∶乙醇1∶2，按照2.1的方法制备丸芯，放入热风循环烘箱内干燥，根据经验分别选择55、60、65、70 ℃的干燥温度，干燥相同的时间，考察丹皮酚含量、水分、溶散时限，结果见表3。

表3 干燥温度的影响

结果表明：不同的干燥温度，干燥相同的时间，丹皮酚及溶散时限差异不明显，但70 ℃干燥的丸芯含水量较低，对丸芯的质量保证更加可靠，因此后续选择70 ℃为中线做进一步考察。

3.1.4 干燥时间的影响 按照2.1的方法制备丸芯，用浸膏相对密度为1.39(30 ℃)、选择润湿剂为纯化水∶乙醇为1∶2，干燥温度为70 ℃，选择不同的干燥时间，考察丹皮酚含量、水分、溶散时限、丸芯外观，结果见表4。

表4 干燥时间的影响

结果表明：随着干燥时间的延长，丹皮酚含量稍有下降，且溶散时限及丸芯外观受很大的影响，因此选择18 h为中线做后续的进一步考察。

3.2 星点设计试验优选六味地黄丸制备工艺

在单因素试验的基础上，应用星点设计-响应曲面法多指标对六味地黄丸制备工艺进行优化。以浸膏相对密度1.39(30 ℃)(A)、润湿剂用量6L(40万丸用量)(B)、干燥温度70℃(C)、干燥时间18 h(D)为考察因素的中线，以水分(Y1)、丹皮酚含量分数(Y2)、溶散时限分数(Y3)、外观质量分数(Y4)为评价指标，计算OD值。

每个因素选择3个水平，响应曲面试验因素水平编码见表5。

表5 响应曲面试验因素水平编码

3.3 响应曲面试验结果分析

利用Design-Expert 8.0.6软件进行试验设计，本试验共含有29个试验点，其中29个为析因点，5个为零点。析因点为自变量取值在所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，其中零点试验重复5次，用以估算试验误差。Box-Behnken试验方案及结果见表6。

采用Design-Expert 8.0.6软件对综合评分结果进行二次多元回归拟合，回归方程Y=0.39-0.032A-0.027B-0.088C-0.16D-0.025AB-0.045AC-0.095AD-0.055BC-0.015BD-5×10-3CD-0.083A2-0.021B2-0.071C2-0.033D2，相关系数r=0.993 8，接近1，说明所建模型与试验拟合较好。详细见表7。

表6 Box-Behnken试验设计及结果

表7 回归模型和方差分析

注：*.差异显著(P<0.05)；**.差异极显著(P<0.01)。

3.4 各因素间相互作用对结果的影响

响应曲面图是根据回归方程绘制的，是响应值在各试验因素交互作用下得到的结果构成的一个三维空间曲面，可以预测和检验变量的响应值以及确定变量的相互关系。AB、AC、AD和BC之间均存在交互作用，根据回归方程做出模型的响应曲面及等高线，见图1。

由图1可知，软件最终筛选出的最佳工艺参数为：浸膏相对密度1.40(30 ℃)、润湿剂(纯化水∶乙醇为1∶2)用量(40万丸用量)6.58 L、干燥温度65 ℃、干燥时间16 h，此状态OD值为0.570 8。

3.5 最佳工艺参数的验证

按照响应面法优化的工艺条件进行3批验证，三批丹皮酚含量分别为0.47、0.45、0.42 mg/丸；水分分别为6.8%、6.5%、6.2%；溶散时限分别为39、36、34 min；将数据用2.3.4的方法计算OD值，分别为0.571 9、0.571 1、0.571 5，与预测OD值比较，偏差为-0.19%、-0.05%、-0.12%。因此，实践结果与模型预测值基本一致，所以利用响应面法得到的六味地黄丸制备工艺参数稳定可靠，具有一定的应用价值。

3.6 丸芯整形、打光及结果

将丸芯置打光锅中，启动打光锅，用95%乙醇及纯化水适量润湿丸粒，然后交替将药汁和50%左右乙醇喷洒至丸芯表面，直至丸芯表面平整，加入滑石粉和药用炭的混合粉末整形至丸面光滑、细腻，撒虫白蜡继续打光40～60 min，然后加入2%硅油蜡打光至光亮，并考察丸子外观、丸重差异、检测丹皮酚含量、溶散时限、水分，结果见表8。

图1 等高线和响应面图

表8 3批验证丸芯整形、打光后结果

4 结论

效应面法是采用多元二次回归方程来拟合效应值与因素之间关系的一种优化统计方法，该设计法具有精度高、预测性好的特点，现已广泛用于药学研究领域[10]。本试验通过单因素考察和响应曲面分析对六味地黄丸制备工艺进行优化，最终筛选出的最佳工艺参数为：浸膏相对密度1.40(30 ℃)、润湿剂用量(40万丸用量)6.58 L、干燥温度65 ℃、干燥时间16 h，此状态OD值为0.570 8。

5 讨论

目前针对浓缩丸的干燥方式有很多中，据文献[11-12]报道的有微波干燥、烘箱干燥，本试验是按照热风循环烘箱开展的研究，优化的制备工艺，待后续继续开展等其他的干燥方式，尤其是微波干燥时对丸子内部成分的影响，以提高产能和效率。另外浓缩丸的生产工艺不同，可能会导致体外溶出度的差异性，如浓缩丸药材的粉碎程度[13]，药粉混合的均匀性，成药的硬度等都对其有一定的影响，故制作工艺的标准化是提高药品质量的重要方面[14]，在本试验的基础上要持续优化其他影响质量稳定性的因素。

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