基于丹参基因组的蛋白磷酸酶2C家族的系统分析△

徐志超，浦香东，宋经元

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所/国家中医药管理局 中药资源保护重点研究室，北京 100193)

蛋白激酶和蛋白磷酸酶所介导的可逆磷酸化反应在植物信号传递和逆境胁迫响应进程中发挥重要调控作用。蛋白磷酸酶按照底物特异性分为丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶类和酪氨酸蛋白磷酸酶类，PP2蛋白磷酸酶作为丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶类的代表，根据亚基结构等分为PP2A、PP2B和PP2C 3类[1]。拟南芥Arabidopsisthaliana的PP2CA亚家族已证实负调控ABA信号通路。化学遗传学和蛋白互作研究揭示PYR/PYL/RCAR复合体为ABA的受体，当ABA信号缺失时，PP2C通过去磷酸化使SnRK2激酶失去活性；而响应ABA信号时，受体PYR/PYL/RCAR与ABA结合后抑制PP2C的活性，SnRK2激酶活性释放并磷酸化下游因子实现信号的传递及细胞对ABA胁迫的响应[2-3]。除了ABA信号途径，PP2C还参与多种植物信号转导途径的调控，如钾通道蛋白、MAPK创伤信号途径等。拟南芥和水稻基因组分别注释到80和78个PP2C家族成员，划分为13和11个亚家族，负调控的PP2CA亚家族基因响应不同的胁迫刺激，如ABA胁迫响应，而PP2CD亚家族可能正调控ABA介导的信号通路[4]。基于基因组系统鉴定植物PP2C基因家族，有助于揭示其在植物逆境胁迫下的响应机制。

次生代谢产物是药用植物主要的药效成分，同时次生代谢产物的产生和积累也是植物对环境胁迫响应的一种适应。环境胁迫影响药用植物的品质，因此药用植物逆境胁迫的分子机制解析将为中药材种植环境及栽培技术的规范提供依据，推动中药材可持续发展。研究证实逆境胁迫虽抑制植物生长，但促进药用植物次生代谢产物的合成和积累，适当的逆境胁迫提升药用植物的品质[5-6]。如适度的干旱胁迫诱导甘草酸合成途径关键酶基因的上调，并促进甘草酸和甘草苷的积累[7]；轻度干旱可显著提高丹参活性成分丹参酮类和丹酚酸类化合物的合成与积累，同时增强植株对磷、钾、钙、等矿质元素的吸收与积累[8]。

丹参为常用大宗药材，遗传多样性丰富，是药用植物次生代谢研究理想的模式植物[9-12]。不同产地丹参品质参差不齐，研究逆境胁迫影响丹参品质的分子机制，将有助于丹参优良品种的种植农艺措施的改良。本研究基于丹参基因组注释PP2C基因家族，揭示PP2C在丹参不同组织部位的差异表达及对茉莉酸甲酯MeJA信号的响应，为丹参逆境胁迫分子机制的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 丹参基因组、转录组数据

丹参基因组组装、注释及转录组测序工作由本课题组完成并已释放[10]。丹参基因组测序原始数据(Roche 454、PacBio RS、Illumina平台)以及不同组织器官及处理的转录组数据(Illumina HiSeq2500测序平台)已上传至NCBI的SRA数据库，登录号：SRX753381、SRR1640458、SRP028388、SRP051564[10-11，13]。

1.2 基于蛋白序列比对的丹参PP2C基因家族成员鉴定

下载拟南芥PP2C基因家族A-L亚家族的蛋白，采用BLASTP比对丹参基因组蛋白序列，Evalue设置为1E-5。从基因组数据库中提取所有PP2C序列，根据NCBI 网站BLASTP比对的结果，利用APOLLO软件校正PP2C成员的CDS、DNA、蛋白序列信息。在蛋白质数据库PROSITE(http：//prosite.expasy.org/)中分析所有蛋白的保守结构域序列。

1.3 PP2C家族成员系统发育、基因结构和保守基序分析

将丹参和拟南芥PP2C家族成员的全长蛋白序列采用MUSCLE做多序列比对，构建NJ(Neighbour-Joining)树，选择Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型，重复次数1000次。基于CDS序列及对应基因组序列，利用在线服务器Gene Structure Display Server(GSDS 2.0)(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)对基因结构进行分析。利用MEME(Suite version 4.9.1)(http：//meme-suite.org/)分析PP2C基因家族成员的保守基序，具体参数：E值小于2×10-30，基序重复次数不限，氨基酸个数10～200个。提取PP2C家族成员启动子区1500 bp通过NEW PLACE在线软件(https：//sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/)分析顺式作用元件。

1.4 PP2C家族基因的差异表达分析

采用已报道[10-11，13]的丹参根组织(周皮、韧皮部、木质部)、根、茎、叶、花以及MeJA处理的转录组数据，通过HISAT2比对到丹参基因组，通过cufflinks计算丹参编码基因的FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)值，筛选出PP2C基因的表达量。FPKM值通过Z-score(Standard score)标准化处理后，采用R语言的gplots下的heatmap来绘制热图。采用皮尔森相关系数(Pearson’s Correlation Tests，r)分析基因在不同组织部位的共表达情况。

2 结果和分析

2.1 丹参PP2C基因家族的注释及系统进化分析

在丹参基因组中共预测到83个PP2C基因成员，基因数量与高等植物中已报道的PP2C基因数量近乎一致，如拟南芥(80)[4]、水稻Oryzasativa(78)[4]、二穗短柄草Brachypodiumdistachyon(86)[14]、谷子Setariaitalica(80)[15]。丹参PP2C的长度范围在145 aa(SMil_00028881)到1048 aa(SMil_00011829)，覆盖基因组的长度在698 bp(SMil_00028881)到8891 kb(SMil_00011829)。

用丹参和拟南芥PP2C的氨基酸序列构建系统发育树，根据拟南芥的亚家族分类，丹参PP2C基因家族被分为13个亚家族A～L(A、B、C、D、E、F1、F2、G、H、I、J、K、L)，各亚家族成员个数分别为11、7、6、8、9、6、4、9、5、2、1、7、2个，其中PP2CA亚家族成员数量最多，如图1所示。除此之外，6个成员聚为其他独立的分枝，暂未命名。丹参PP2C基因家族成员两两比对计算同源关系，发现PP2CF1亚家族的SMil_00030307和SMil_00028881的同源关系最近为98.57%，而SMil_00011829(PP2CL)与SMil_00021239(PP2CC)的同源关系最低为16.46%。

2.2 丹参PP2C基因家族的基因结构分析

PP2C基因家族的基因结构显示亚家族内和不同亚家族间基因结构差异较大，内含子数量变异较大，其中PP2CL亚家族的SMil_00011829内含子数量最多，为15个。丹参PP2CA亚家族的11个成员，命名为SmPP2CA1-SmPP2CA11，内含子数量为2～7个，多数为3个内含子，基因结构相似，如图2所示。

PP2CA亚家族各基因氨基酸大小在286～541 aa，等电点在4.78～6.84，分子量大小31～58 kD。对PP2CA亚家族的11个基序motif进行预测，Motif 1在11个亚家族成员中保守存在，大部分PP2CA成员保守存在motif 2、4、5、6、7。PP2A亚家族的系统进化分析显示3个同源分枝，其中同源分枝2和3的两对亚家族成员的基因结构和保守结构域基本相同。

2.3 PP2C基因的差异表达分析

丹参酮是丹参重要的脂溶性活性成分，丹参根及根周皮是丹参酮的合成和积累部位[11]。本研究对丹参不同组织部位，如根、茎、叶、花、根周皮、根韧皮部和根木质部的转录组数据比对到丹参基因组，计算FPKM值，将FPKM值用scale函数做Z-score标准化处理并聚类，如图3所示。

图1 丹参PP2C基因家族系统进化分析

差异表达结果显示28.91%(24)的基因低表达(FPKM<10)，其中7个基因显示沉默表达(FPKM<1)。丹参根3个组织部位(周皮、韧皮部、木质部)的PP2C基因表达聚在一起。组织特异性表达分析发现：PP2CE亚家族的SMil_00028462和SMil_00013051两个基因在花中特异表达，可能与花发育的调控相关；PP2CE亚家族的SMil_00004715在丹参根周皮特异高表达，在茎、叶、花等器官表达极低，推测间接调控丹参酮的生物合成。3个PP2CA亚家族基因在丹参组织器官中表达低(FPKM<10)，PP2CA亚家族的同源分枝3的两个基因在丹参不同组织部位中表达最高，且在根、茎、叶、花中表达差异不显著，呈共表达(r=0.81)。茉莉酸甲酯MeJA作为重要的信号转导因子能够诱导植物次生代谢产物的产生，在丹参中MeJA能够正调控丹参酮的生物合成。对于丹参叶片MeJA处理12 h后的转录组数据，分析丹参PP2C家族成员编码基因的表达，发现13个PP2C基因在MeJA处理下显著降低，其中包含6个PP2CA和3个PP2CK亚家族的基因。PP2CA亚家族同源分枝2的两个基因在丹参所有转录组(不同组织器官及MeJA处理)的表达中呈显著共表达(r=0.95)。

分析丹参PP2CA基因的启动子中的顺式作用元件发现：PP2CA的启动子中ABA响应元件(ABRE，ACGTGG)均有分布(见表1)，大部分启动子区呈密集分布，与响应ABA信号密切相关；在PP2CA的启动子中富含WRKY、MYB和MYC 3类转录因子的作用元件(见表1)，推测在响应逆境胁迫时受转录因子的调控；干旱和低温响应的元件部分分布。

表1 丹参PP2CA亚家族成员启动子区顺式作用元件分析

注：ABRE、DRE、LTRE代表响应ABA信号、干旱、低温的作用元件；WRKY、MYB、MYC、GCC代表转录因子WRKY、MYB、MYC、AP2的结合元件。

3 讨论

本研究基于丹参全基因组测序，系统鉴定蛋白磷酸激酶PP2C家族成员，丹参基因组注释的PP2C基因数量(83)与已报道的植物中相似；丹参与拟南芥PP2C序列的系统进化显示丹参PP2C亚组的分类与拟南芥相似，亚家族成员数量也大多相似，保守结构域相似度高，证明PP2C基因家族及其基因结构在植物中进化较为保守。低等维管植物(石松纲)卷柏Selaginellatamariscina[16]中的PP2C基因家族鉴定到46个成员(未发表)，远少于已报道的高等植物，PP2C在进化过程中应对复杂逆境环境时显著的基因扩张反映PP2C基因家族在植物逆境响应进程中重要的调控作用。

PP2CA亚家族成员作为ABA的受体之一，负调控ABA信号转导途径，响应多种逆境胁迫，如干旱、低温等[17-19]。丹参PP2CA基因启动子含有多种逆境胁迫应答的顺式作用元件如ABRE、DRE、LTRE等，大多数的PP2CA基因响应MeJA信号转导因子。PP2CA的同源分枝2、3的基因结构相似，motif高度保守，且显著共表达，推测为基因组复制导致的相似或相同功能基因的分化。有报道指出植物中ABA信号与花发育相关，如ABA信号途径中一个正调控因子ABI4(乙烯响应的转录因子)正调控开花关键基因FLC的转录，进而负调控开花时间[20]。丹参PP2CE亚家族的两个基因在花中特异表达，一个基因在根中特异高表达，预测PP2CE亚家族与植物组织器官发育相关，如根和花的发育，但需要进一步的实验验证。

丹参是最常用的大宗药材之一，生态适应性较强，种植面积广泛分布在华东、华北、西北、西南、中南等地区，野生资源大幅减少，主要来源于人工栽培品，然而不同产地的丹参品质差异明显。研究指出轻度干旱可显著提高丹参活性成分丹参酮类和丹酚酸类化合物的合成与积累，同时增强植株对矿质元素的吸收，因此丹参对不同环境的适应导致活性成分合成和积累的差异，揭示丹参对逆境胁迫的分子机制有助于指导丹参优良品种的栽培与繁育。丹参PP2C基因家族的系统分析将为丹参响应逆境胁迫分子机制的解析奠定基础，同时丹参作为药用模式植物，将对其他药用植物的栽培育种及道地性的理解具有指导意义。

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