发酵虫草菌粉多糖成分的理化性质及其对ConA抑制L-O2细胞增殖活性的影响

蒋洪亮，麻浩，何丽芳，赵修南，单俊杰*，王海南，3*

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.军事科学院 军事医学研究院 毒物药物研究所，北京 100850；3.国家药品监督管理局，北京 100053)

发酵虫草菌粉(Cs-4)是由我国科技人员从天然冬虫夏草分离获得Cs-4菌株，经人工发酵培养制成。已有文献报道将其用于肝病的治疗，作为补益类药物，推测多糖可能是其主要的药效物质之一。为此，将发酵虫草菌粉(Cs-4)粗多糖进行一系列分离纯化，获得均一成分CSMP-60-B-I，对其理化性质及其对ConA抑制人源肝细胞增殖活性的拮抗作用进行了初步研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-2000紫外分光光度计(上海龙尼柯仪器有限公司)；高效液相色谱仪(美国Waters公司Delta 600，2414示差检测器)；分析天平(Ohaus公司)；LGJ-25 C冷冻干燥机(北京四环冻干机厂)；DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；QL-861涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；MCO-15AC孵育箱(SANYO公司)；3001闪烁扫描酶标仪(Thermo公司)；BSZ-100型自动部分收集器(上海青浦沪西仪器厂)；Beckman P/ACETMMDQ Capillary Electrophoresis System(美国贝克曼库尔特公司)。

1.2 材料

发酵虫草菌粉(Cs-4，江西国药有限责任公司，批号：Z10890021)。二乙胺基乙基纤维素(DEAE-Cellulose，上海恒信化学试剂有限公司)；Sephadex G-100(Pharmacia公司)；单糖、葡萄糖标准品(Sigma公司)；峰高分子量为6000、1.04×104、4.0×104、6.6×104和2.0×105Da的葡聚糖(Sigma公司)；三氟乙酸(TFA，99%，ACROS ORGANIC公司)；1-苯基-2-甲基-4-吡唑啉酮(PMP，99%，Aldrich公司)；人正常肝细胞株L-O2(军事医学科学院毒物药物研究所李前教授惠赠)；DMEM培养液(Gibco公司)；RPIM-1640液(Gibco公司)；胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司)；胰蛋白酶(Amresco公司)；噻唑蓝(MTT，Amresco公司)；刀豆蛋白A(Concanavalin，ConA，Sigma公司)；十二烷基硫酸钠(SDS，Amresco公司)；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 多糖CSMP-B-1的制备

称取发酵虫草菌粉1 kg，加15 L去离子水，置于60 ℃水浴中加热提取4 h，然后多层纱布滤过，滤渣在相同条件下再重复提取1次。合并滤液，离心(3000 r·min-1，10 min)，上清液50～55 ℃减压浓缩，浓缩液加入3倍体积95%乙醇水，静置醇沉48 h。离心(3000 r·min-1，10 min)，分离沉淀，沉淀部分多次加入去离子水重复溶解多糖，离心(3000 r·min-1，20 min)得上清液，膜透析上清液72 h，以除去小分子杂质。将袋内透析液离心，上清液减压浓缩后，进行冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉粗多糖CSMP-60[1-3]。

称取CSMP-60粗多糖1 g，加入20 mL水，置于60 ℃水浴中加热溶解，离心，沉淀再重复操作1次。合并上清液上样DEAE-纤维素色谱柱(6.0 cm×30 cm)，依次采用H2O、0.25 和0.5 mol·L-1NaHCO3洗脱，苯酚-硫酸法检测含糖组分[6]，收集0.25 mol·L-1NaHCO3洗脱的含糖组分，水透析脱盐、浓缩和冷冻干燥获得多糖组分CSMP-60-B。CSMP-60-B再经过Sephadex-G-100柱进一步分离和纯化，最终获得分子量均一多糖CSMP-60-B-1[4-6]。

2.2 CSMP-B-1的理化性质测定

2.2.1 纯度鉴定和峰高分子量测定 用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)方法，以TSK gel-G3000 PWXL(7.8 mm×300 mm)为色谱柱。流动相：0.1 mol·L-1Na2SO4溶液；进样体积：20 μL；柱温箱温度：35 ℃；检测器为2414示差检测器和2998紫外检测器。分别准确称取5 mg峰高分子量为6000、1.04×104、4.0×104、6.6×104和2.7×105Da的葡聚糖标准品，分别加入500 μL 0.1 mol·L-1Na2SO4溶解，0.22 μm水系微孔滤膜过滤。滤液上样。采用Waters Empower 2.0 GPC软件处理实验数据，以标准葡聚糖的保留时间(tR)为横坐标，分子量的对数(lg Mp)为纵坐标，绘制多糖分子量的标准曲线。

准确称取5 mg多糖CSMP-60-B-1，同样加入500 μL 0.1 mol·L-1Na2SO4溶解、过滤和进样。根据样品峰形状和保留时间，判断多糖纯度和计算其峰高分子量[7]。

2.2.2 单糖组成测定 CSMP-B-60-1完全酸水解：称取5 mg CSMP-B-60-1，加入5 mL三氟乙酸(TFA)，密封后置于120 ℃烘箱中加热2 h进行完全酸水解反应。水解液再多次加入甲醇，反复减压蒸除残留的三氟乙酸。待进行PMP衍生化。

单糖PMP衍生化[8-10]：准确称取单糖标准品(氨基葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸)各10 mg，加5 mL超纯水溶解，涡旋混匀。取40 μL标准单糖混合液于试管中，依次加入600 μL 0.3 mol·L-1氢氧化钠和600 μL 0.5 mol·L-1PMP-甲醇溶液(现用现配)。涡旋混匀，在70 ℃水浴中反应30 min，取出自然冷却至室温。缓慢加入600 μL 0.3 mol·L-1盐酸，使溶液pH为7。加1 mL三氯甲烷萃取，向水相继续加入1 mL三氯甲烷，重复萃取2次，合并水相，水相经0.22 μm滤膜滤过，进毛细管电泳分析。CSMP-B-60-1完全酸水解产物也按相同的PMP衍生方法，制备单糖衍生物，然后进行毛细管电泳分析。

毛细管电泳条件：缓冲盐溶液为50 mmol·L-1硼砂溶液(pH=10.57)；毛细管柱为Φ50 μm×60 cm；分离电压为15 kV；检测波长为245 nm；进样压力为0.5 psi(1 psi=6.895 kPa)；进样时间为10 s；柱温为25 ℃。

2.3 细胞培养

细胞常规传代培养条件：从液氮冷冻保存的容器中取出L-O2细胞株，经常规处理后接种入添加含10%FBS的DMEM液的玻璃瓶中，放于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的孵育箱静置培养。3～4 d传代1次，传代时弃去培养上清液，用PBS淋洗1次，经0.125%胰酶和0.01% EDTA-Na2的混合液消化后，以含10%FBS的DMEM液制成细胞悬液，按 1∶3传代培养扩增，备用。

2.4 MTT法检测细胞增殖活性

实验设正常组、ConA模型组和多糖组，每组设平行6复孔。取对数生长期L-O2细胞，经消化处理后，以10%FBS的DMEM液制成单细胞悬液，用Trypan blue液染色，WBC计数法计数活细胞总数，接种入96孔细胞培养板，密度为1×104/孔，培养箱孵育贴壁5 h。然后各多糖组分别加入用RPIM-1640液配制的使其终质量浓度为10、50、250 μg·mL-1的多糖(具有均一分子量)溶液。ConA模型组和多糖组再加入用RPIM-1640液配制的ConA溶液(500 μg·mL-1)。按常规静置共孵育72 h。MTT显色法检测：向含有培养物的96孔板每孔加入0.5%MTT液20 μL，继续于孵育箱培养4 h，去上清液，加入10%SDS液200 μL/孔，37 ℃温箱过夜后在闪烁扫描酶标仪上570 nm波长检测吸光度(A)值[11]。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 多糖组分

粗多糖经过DEAE-纤维素柱洗脱后，得3个洗脱峰，从左至右分别命名为CSMP-60-A(去离子水洗脱)，CSMP-60-B(0.25mol·L-1NaHCO3洗脱)，CSMP-60-C(0.5 mol·L-1NaHCO3洗脱)，结果见图1。

图1 CSMP-60在DEAE-纤维素柱洗脱曲线

CSMP-60-B进一步用Sephadex-G-100纯化，用苯酚-硫酸法测定λ=490 nm的吸收峰，用λ=280 nm检测非糖物质的吸收峰。最终CSMP-60-B组分经过凝胶柱色谱分离得到单一峰，收集43管至63管，得到CSMP-60-B-I，结果见图2。

图2 CSMP-60-B在Sephadex G-100柱洗脱曲线

3.2 多糖纯度及峰高分子量

运用高效凝胶渗透色谱法测得CSMP-60-B-I峰高分子量32 336 Da，而且峰型为单一对称峰，结果见图3。

图3 CSMP-60-B-I的高效凝胶渗透色谱图

3.3 单糖组成

运用毛细管电泳测得CSMP-60-B-I的单糖组成及比例为木糖-阿拉伯糖-葡萄糖-半乳糖-甘露糖(0.09∶0.20∶1.00∶3.70∶3.58)。标准单糖混合物和CSMP-60-B-1单糖混合物的CE图谱分别见图4和图5。

3.4 CSMP-60-B-I对ConA抑制L-O2细胞增殖活性的影响

模型组ConA对L-O2细胞增殖活性具有明显抑制作用，CSMP-60-B-I低、中、高剂量均对ConA抑制L-O2细胞增殖活性有拮抗作用，且呈现一定的量效关系，结果见表1。

注：1.氨基葡萄糖；2.木糖；3.阿拉伯糖；4.葡萄糖；5.鼠李糖；6.岩藻糖；7.半乳糖；8.甘露糖；9.葡萄糖醛酸；10.半乳糖醛酸。图4 标准单糖PMP衍生物的CE图谱

注：1.木糖；2.阿拉伯糖；3.葡萄糖；4.半乳糖；5.甘露糖。图5 CSMP-60-B-I单糖衍生物的CE图谱

表1 CSMP-60-B-I对ConA抑制L-O2细胞增殖活性的影响

注：与正常组比，***P<0.001；与模型组比，##P<0.01，###P<0.001。

4 讨论

将发酵虫草菌粉在60 ℃进行连续提取，制备粗多糖。利用DEAE-cellulose离子交换树脂柱色谱和Sephadex-G-100 凝胶柱色谱对发酵虫草菌粉粗多糖进行纯化后得到白色粉末CSMP-60-B-I。

高效凝胶渗透色谱法具有操作简单、快速、灵敏、重复性好和样品量少等特点，成为目前测定多糖相对分子质量及其分布最理想的方法。应用高效凝胶渗透色谱法对CSMP-60-B-I进行纯度鉴定，确定其为分子量均一的多糖，峰高分子质量为32 336。当然，通常所谓的多糖纯品实质上是一定相对分子质量范围的均一组分，它的纯度只代表相似链长的平均配布。

多糖的单糖组成分析必须使用高效的分离技术，方可实现多糖组成单糖的有效分离。多糖单糖组成分析较常用的方法有薄层色谱法、气相色谱法、HPLC、毛细管电泳法、离子色谱法等。毛细管电泳法具有样品用量少、时间短、灵敏度高、分离效果明显等优点，采用毛细管电泳法对CSMP-60-B-I进行单糖组成分析，结果显示CSMP-60-B-I的单糖主要为葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及少量木糖和阿拉伯糖。关于CSMP-60-B-I的结构分析，将随着实验的深入另文报道。

已有研究显示，高浓度ConA对肝细胞有损伤作用[12]，能抑制细胞增殖。而CSMP-60-B-I加入后，这种抑制作用大大减弱，在一定范围内，随着剂量增加，甚至促进肝细胞的增殖。这一结果提示，CSMP-60-B-I可能对肝细胞有保护作用，其确切的保肝作用尚有待体内实验的进一步证实。

[1] 刘鹏，程显好，刘亚丽，等.虫草菌丝体多糖的提取方法[J].食品与发酵工业，2007，33(3)：227-231.

[2] 刘华晶，许修宏，马怀良，等.蛹虫草菌丝体粗多糖提取方法初探[J].东北农业大学学报，2008，39(1)：58-61.

[3] 韩永萍，林强，何绪文.虫草菌丝体多糖的提取研究[J].中国食用菌，2007，6(6)：53-55.

[4] 刘金花，李富奎，贾得儒，等.中国被毛孢发酵虫草菌丝体多糖的提取、纯化及其理化性质[J].食品与发酵工业，2014，40(3)：222-226.

[5] 黄建忠，施巧琴，周晓兰，等.粉被虫草菌丝体多糖的分离纯化及其性质[J].福建师范大学学报，1998，14(3)：82-85.

[6] 郑必胜，唐芳勇，闫文娟，等.苯酚-硫酸法测定广东虫草菌丝体多糖含量的研究[J].农产品加工·学刊，2008(8)：18-22.

[7] 黄小方.板蓝根多糖提取分离及其分子量测定的研究[D].扬州：扬州大学，2007.

[8] 张海英，凌建亚，吕鹏，等.毛细管区带电泳定性分析蒙山九州虫草菌丝体和发酵液多糖水解液组分[J].复旦学报(医学版)，2007，34(3)：447-449.

[9] 文松.板蓝根多糖佐剂理化性质及作用机理研究[D].贵阳：贵州大学，2015.

[10] 杨洁，姜廷福，王远红，等.高效毛细管电泳法测定海参多糖的单糖组成[J].中国海洋大学学报，2011，41(增刊)：344-348.

[11] 滕芳芳，胡晓斐，刘晨晨，等.LPS致肝细胞损伤模型的建立研究[J].安徽农业科学，2014，42(4)：1071-1073.

[12] 曹怡，刘波，徐彭，等.淫羊藿苷干预ConA 诱导体外BRL-3A 细胞损伤的机制[J].中药药理与临床，2015，31(3)：21-24.