利用ISSR分子标记的特征条带鉴别正毛化橘红△

胡珊，杨志业，邬龙怡，李华，计周正*

(1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.广东省药品检验所，广东 广州 510180)

化橘红为芸香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮[1]，具有散寒、燥湿、消痰等功效，用于风寒咳嗽，喉痒痰多[2]。化橘红为广东化州道地药材，根据其果实表面绒毛的有无、多少分为大致正毛化橘红、副毛化橘红和光青化橘红，品质和功效以正毛化橘红最优[3-5]、副毛化橘红次之、光青化橘红最差，假西洋品种是外观介于正毛和副毛之间、功效介于副毛和光果的一个较特殊品种，而正毛化橘红和非正毛化橘红的种苗在外观形态非常相似，运用传统方法很难准确区分。以生物分子的多态性为基础的遗传标记，即DNA水平的分子标记如RAPD、ISSR分标记[6-7]等，相对于传统形态标记具有巨大优势，为解决品种混乱和品种优劣问题提供了一种新的手段。本文在ISSR分子标记的基础上建立了一种利用PCR特征条带组合来鉴别正毛化橘红种苗的方法，该方法快速、简便且准确性高，只需要少量样本即可实现正毛化橘红种苗的鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料来源

研究实验：正毛化橘红、副毛化橘红、光青化橘红等样品均来自广东省化州市和茂名市，并经广东省药品检验所杨志业副主任中药师鉴定。其中正毛化橘红样品8份，副毛化橘红5份，假西洋品种3份，光青化橘红2份。采集其新鲜叶片并用硅胶快速干燥，采样时间为2016年5月，样品信息见表1。

表1 研究实验样品的来源及品种

验证实验：2017年5月在广州市香雪制药股份有限公司的化州橘红种植基地随机选择已挂果的部分正毛化橘红、副毛化橘红、假西洋品种和光青化橘红共80棵，品种信息经广东省药品检验所杨志业副主任中药师鉴定，其中正毛化橘红24株，副毛化橘红21株，假西洋品种23株，光青化橘红12株。采集其叶片并做好其编号和品种信息记录，具体情况见表样品信息详见表2。

1.2 试剂

Taq DNA聚合酶、10×Taq缓冲液、dNTPs[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]；PCR扩增引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；化学试剂均为分析纯。

1.3 仪器

5418型高速离心机(Eppendorf，德国)；C1000 TouchTMwith 48/48 Fast Reaction型PCR扩增仪(BioRad，美国)；Gel DocTMXR+型凝胶成像系统(BioRad，美国)

表2 验证实验化橘红样品的品种情况

1.4 方法

1.4.1 DNA提取与检测 采用天根植物基因组试剂盒提取所有样品的基因组DNA。用微量紫外核酸仪检测DNA浓度和纯度。将合格样品DNA浓度稀释至20 ng·μL-1后置于-20 ℃保存备用。

1.4.2 ISSR分子标记的引物筛选及PCR扩增 PCR反应体系：10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.5 μL，引物(10 μmmol·L-1)0.5 μL，Taq DNA聚合酶1.5 U，DNA模板50 ng，用纯水补足25 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，35个循环，72 ℃ 10 min；电泳条件：取10 μL PCR产物与1 μL上样缓冲液混匀，于1×TAE、5 V·cm-1电泳30 min，用凝胶成像系统照相存盘，每个处理重复2次。对50条ISSR引物进行分析，筛选出条带清晰、多态性好的ISSR引物，并用筛选到的引物对SN1～SN18的DNA模板进行PCR扩增和电泳，每个处理重复2次。

1.4.3 PCR扩增的条件优化 选用L16(54)正交试验设计(表3)，对Mg2+、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶、引物和DNA用量进行5因素4水平的正交试验。以正毛化橘红SN2样本的DNA为模板，引物827作为扩增引物，反应总体积25 μL，含有10×PCR Buffer 2.5 μL，每个处理重复2次。

表3 PCR反应正交体系浓度表

1.4.4 验证实验 以2017年5月采集的化橘红(表2)叶片DNA为样品进行验证实验，在正交实验的基础上选择最优的PCR体系进行扩增反应，扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。扩增反应结束后，取10 μL扩增产物加入1 μL 10×loading buffer用1.0%琼脂糖凝胶，于1×TAE、5V·cm-1电泳30 min，凝胶成像仪下拍照。每个处理重复2次。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

将提取的所有样品的基因组DNA在超微量紫外分光光度计下测量其浓度和纯度，得到其A260/A280均在1.8～2.0之间，说明DNA纯度较高，符合PCR技术要求。

2.2 正毛化橘红特征条带分析及引物选择

在50条ISSR随机引物筛选过程中发现引物818和827有不同于其他引物的特征条带，其组合能够鉴别正毛化橘红。引物序列：818——CACACACACACACACAG，827——ACACACACACACACACG。

图1和图2分别为ISSR随机引物818和827的电泳图谱，第1～18泳道对应的样品分别为表1中SN1～SN18。图1中第3～5、11、13、14、18泳道在200～500 bp之间接近500 bp处有一条条带(白线圈出的条带)，而其他泳道没有，这7个泳道对应的化橘红样品分别是SN3副毛、SN4假西洋、SN5光青、SN11假西洋、SN13副毛、SN14光青和SN18假西洋，其他泳道为正毛化橘红和部分副毛化橘红，说明正毛化橘红是没有这一特征条带的。图2中第2、3、6～8、10、12、13、15、17泳道在200～500 bp之间接近500 bp处有明显的条带(白线圈出的条带)，而其他泳道没有，这10个泳道对应的化橘红样品分别为SN2正毛、SN3副毛、SN6正毛、SN7正毛、SN8正毛、SN10正毛、SN12正毛、SN13副毛、SN15正毛、SN17正毛，说明假西洋品种、光果、部分副毛化橘红没有这一特征条带。综合引物818和827的电泳图谱可以看出，正毛化橘红的标记为(0，1)，即正毛化橘红DNA用引物818扩增没有最下方的条带，用827扩增有最下方的条带；副毛化橘红的标记为(0，0)或(1，1)，光果和假西洋品种的标记为(1，0)。因此通过818和827这两个引物的特征条带能够将正毛化橘红筛选出。

注：泳道1～18分别对应表1中的样品SN1～SN18。图1 引物818的电泳图谱

注：泳道1～18分别对应表1中的样品SN1～SN18。图2 引物827的电泳图谱

2.3 PCR体系优化

使用正毛化橘红SN2的DNA模板、引物827对PCR反应体系进行优化的电泳结果见图3，本方法是采用特征条带来鉴别正毛化橘红，因此特征条带明显、杂带少是关键。条件3、4、6、8、11、12、15、16这八个条件杂带较多，而条件1和条件2因其DNA模板浓度太低可能存在潜在的不稳定性，综合各个条件的重复性和稳定性，最终选择条件14，即PCR反应体系为10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.7 μL，引物(10 μmmol·L-1)0.5 μL，Taq DNA聚合酶2.0 U，DNA模板65 ng。用该条件对引物818进行PCR扩增，其特征条带也非常清晰，只是其他条带稍多。为了使本研究建立的方法更加简便，对引物818和827采用同样的PCR扩增体系。

注：泳道1～16分别为表3中1～16组不同PCR反应体系。图3 正交体系优化电泳图谱

2.4 验证实验

图4-图7分别为表2的化橘红DNA模板采用引物818和827扩增的电泳图谱，Marker右侧的泳道从左到右依次为表2的编号从小到大的顺序。将所有样品的818和827特征条带进行统计，有特征条带记为1，无特征条带记为0，结果见表4。由表可知，所有正毛化橘红的标记均为(0，1)，副毛化橘红的标记为(0，0)或(1，1)，光果和假西洋品种的标记为(1，0)。由电泳图谱可知，所有正毛化橘红在200～500 bp之间均无818的特征条带，均有827的特征条带，说明通过818和827这两个引物的特征条带能够将正毛化橘红鉴别出。

注：泳道1～48分别对应表2中的样品1～48。图4 化橘红的引物818的电泳图谱-1

注：泳道49～80分别对应表2中的样品49～80。图5 化橘红的引物818的电泳图谱-2

注：泳道1～48分别对应表2中的样品1～48。图6 化橘红的引物827的电泳图谱-1

注：泳道49～80分别对应表2中的样品49～80。图7 化橘红的引物827的电泳图谱-2

3 讨论

ISSR分子标记技术因其具有稳定、多态性高、简便易操作及不受环境因素影响等优势，已被广泛应用到药用植物种质资源鉴定、亲缘关系分析及道地性研究，并取得良好效果[8]。张春等[9]利用ISSR分子标记技术对药用当归及其混伪品进行鉴别，找到了当归及其混伪品间的特异鉴别引物，为建立稳定的当归质量评价体系提供了技术支持。魏艺聪等[10]采用ISSR标记分析草珊瑚的DNA指纹图谱，结果证实ISSR分子标记可以有效辨别18份受试草珊瑚样品。ISSR分子标记的后期实验数据处理一般采用聚类分析方法，得到聚类分析图谱，但缺乏统一标准[8]，因此在生产推广应用上收到限制。本研究是在ISSR分子标记技术的基础上找到正毛化橘红的特征条带组合，建立了通过2条引物鉴别正毛化橘红的PCR方法，并且进行了大量样品的验证。该方法快速简便且准确，且无需通过聚类分析，直接根据特征条带来鉴别正毛化橘红，可以应用于化橘红种植基地的种苗筛选中，得到品质最好的正毛化橘红种苗，为优质化橘红种苗的筛选提供技术支持。

表4 化橘红的品种及特征条带情况

由于ISSR标记利用的是非特异引物，其扩增条带的稳定性是相对的，因此在进行PCR时需要严格保证各项条件一致才能得到较稳定的电泳条带，最理想的结果是将其转化为采用特异引物对扩增的SCAR分子标记。在本研究中已经找到正毛化橘红的特征条带组合(特征标记)，下一步可考虑将ISSR标记中的特异性条带回收、克隆和测序，设计特异引物对，转化成SCAR标记，以建立更加稳定的分子鉴定方法。

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[6] 林励，欧剑锋，肖凤霞，等.化橘红种质资源的随机扩增多态性DNA分析[J].广州中医药大学学报，2008，25(4)：350-354.

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[8] 任梦云，陈彦君，张盾，等.ISSR标记技术在药用植物资源中的研究进展及应用[J].生物技术通报，2017，33(4)：63-69.

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