高效液相色谱法测定刺梨果酒中维生素C含量

彭小东，李红洲，陈大鹏，王 欢，常 茜，张 建

(1.贵州省产品质量监督检验院，贵阳550013；2.贵州工业职业技术学院，贵阳550008；3.贵州师范大学，贵阳550025)

刺梨（Rosa roxburghiiTratt）是一种具有很高营养价值的水果，富含各种维生素、氨基酸、多糖及微量元素，更有“维C之王”的称号，每100 g刺梨中维生素C的含量高达2200～2500 mg[1]。刺梨发酵型果酒的酒精度普遍较低，保留了刺梨中的维生素、氨基酸和矿物质等营养元素[2]，比以粮食酒为原料的蒸馏酒有更高的营养价值[3-4]，具有调节人体新陈代谢、促进血液循环、控制体内胆固醇水平、抗衰老等医疗保健作用[5-6]。测定刺梨果酒中的维生素C含量可以为刺梨果酒的开发利用提供参考。现行国家标准GB 5009.86—2016中维生素C的测定方法有：高效液相色谱法、荧光法、2，6-二氯靛酚滴定法[7]。其中高效液相色谱法具有高效、稳定、适用广等特点，本研究通过对高效液相色谱法测定刺梨果酒中维生素C含量，为刺梨果酒的维生素C提供科学的检测参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

试样：某酒类公司生产的刺梨果酒。

试剂：维生素C标准物质：Dr Ehrenstorfer GmbH 公司，CAS：50-81-7；草酸、盐酸、磷酸、偏磷酸、磷酸二氢钾均为分析纯。

仪器设备：Aglient 1260 II高效液相色谱仪（配紫外检测器），美国安捷伦公司；混匀振荡器，Heidolph公司；SB25-12DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；移液器，德国普兰德公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱，Poroshell 120 EC-C18柱(100mm×4.6mm×2.7 μm，美国安捷伦公司)；流动相，0.5% 的磷酸二氢钾溶液，pH2.0～3.0；流速，1 mL/min；进样量，10 μL；柱温，35 ℃；紫外检测器，检测波长：250 nm。

1.2.2 标准曲线的绘制

准确称取维生素C标准物质1.0 g（精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，超纯水溶解并定容，得100 mg/mL的标准使用液，用超纯水逐级进行梯度稀释，获得2.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100 μg/mL标准工作液。

1.2.3 样品前处理

准确移取1 mL的刺梨果酒样品于50 mL的容量瓶中，用提取试剂定容至刻度，超声振荡提取10 min，过0.22 μm的水系膜，待上机。

1.2.4 计算公式

维生素C含量的计算，见式（1）：

式（1）中：X为样品中维生素C的含量，mg/L；C为标准曲线定量的样品维生素C的浓度，μg/mL；C0为空白的维生素C的浓度，μg/mL；V为定容体积，mL；v为取样体积，mL；d为稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及线性方程

维生素C标准曲线见图1，由图1可知，维生素C在0.5～20 μg/mL浓度范围内线性良好，回归方程：Y=31.74429X-1.52931，相关系数r=0.9994。

图1 维生素C的标准曲线

2.2 方法的精密度及检出限

精密度：对同一浓度的维生素C标液连续6次进样测定，根据峰面积计算其精密度，结果见表1。

由表1数据可知，6次重复测定的相对标准偏差为0.73%，保留时间稳定（图2），均在1.652 min，表明该方法的重现性良好。

检出限：以3倍信噪比（S/N）的计算检出限，在取样量为1 mL时，维生素C的方法检出限为0.99 mg/L。

2.3 不同提取试剂对刺梨果酒中维生素C含量测定的影响

分别以2%的草酸、盐酸、磷酸、偏磷酸作为提取试剂，对刺梨果酒中的维生素C含量进行测定，并对其进行加标回收试验，加标量为100 μg/mL，实验结果见表2。

表1 维生素C测定方法的精密度

表2 不同提取试剂对刺梨果酒中维生素C含量测定的影响

图2 10 μg/mL维生素C标准溶液叠加色谱图（n=6）

如表2所示，草酸和偏磷酸作为提取试剂时，测得刺梨果酒中维生素C结果较为一致，且较之其他两种提取试剂的测定数据要高，盐酸次之，磷酸最低，RSD为0.33%～1.20%，表明不同提取试剂对刺梨果酒中维生素C测定结果有影响。

4种提取试剂的加标回收率在96.7%～104.8%之间，回收率良好，数值相近。

2.4 不同提取浓度对刺梨果酒中维生素C含量测定的影响

实验采用不同浓度梯度（0.5%、1%、5%、8%、10%）的提取剂，考察其对刺梨果酒中维生素C含量测定的影响，结果见表3。

如表3所示，从提取剂的浓度来看，草酸、偏磷酸均在8%时，测定结果最大，分别为78.4%和79.1%，盐酸在1%时最大，三者差异不大。磷酸则随浓度的升高，测定结果不断升高，在8%、10%浓度时达到最高，但较之其他几种提取试剂的测定结果有很大差异，只有提取效果最好组（8%的偏磷酸）的76.5%，其RSD值较之其他几种提取试剂也较大，表明磷酸提取效果不好。

表3 不同浓度的提取剂对维生素C测定结果的影响

3 结论

采用超声振荡提取，高效液相色谱，紫外检测器检测，测定刺梨果酒中的维生素C含量。结果表明：该方法线性良好（r=0.9994），重现性较佳（RSD=0.73%），回收率高（96.7%～104.8%）；草酸、偏磷酸提取剂均在8%的浓度下提取效果最佳，盐酸在1%的浓度时效果最好，三者的提取最佳值相近；磷酸提取效果不好，提取最高值只有效果最好组（8%的偏磷酸）的76.5%，且提取浓度要求高；因此，结合提取效果及经济效益（提取浓度）考虑，可选用1%的盐酸作为提取剂。该方法操作简单、快捷、重现性好、回收率高，适用于刺梨果酒中维生素C的检测。

[1]熬芹,谷晓平,孟维亮.贵州刺梨研究进展[J].耕作与栽培,2010(6)：1-3.

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[5]HAZELWOOD LA,DARAN J M,VAN MARIS A J A,et al.The Ehrlich pathway for fusel alcohol production:a century of research onSaccharomyces cerevisiaemetabolism[J].Appl environ microb,2008,74：2259-2266.

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[7]中华人民共和国卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定：GB 5009.86—2016[S].北京：中国标准出版社,2017.