共固定化酶制备奶香基料的研究

2018-06-20陈萧萧黄敏玲汪薇任文彬白卫东刘功良

中国乳品工业 2018年5期

陈萧萧，黄敏玲，汪薇，任文彬，白卫东，刘功良

(仲恺农业工程学院轻工食品学院，广州510225)

0 引言

奶味香精是香精香料领域中投资最大、开发研究最为活跃的香精之一，可以给食品原料赋香，矫正不良气味，弥补食品中原香气的不足，辅助和稳定食品中固有香气[1-2]。而以酶解乳脂为基料的复合型奶香香精能克服了调配型奶味香精口感单薄的缺陷，是当前研究的热点[3-4]。但由于酶的造价比较高，而且使用游离酶进行酶解反应时，酶只能使用一次而不能回收，导致产物的生产成本较高且后续分离步骤复杂，影响了利用酶应用的商业化。与游离酶相比，共固定化酶能同时固定化多种酶，还能保持其高效、专一及温和酶催化反应特性的同时，还具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点[5-7]。本文将蛋白酶和脂肪酶进行共固定化，探讨了其对制备奶香基料的影响。

1 实验

1.1 材料与试剂

多美鲜无盐黄油，乳清粉，脂肪酶A 12 K，脂肪酶M ER和蛋白酶M SD由阿玛诺天野酶制剂，海藻酸钠，CaC l2，乙醇，乙醚，氢氧化钾，酚酞指示剂等均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 共固定化酶的制备

准确称取1 g海藻酸钠固体，加入去离子水，加热溶解，配成1%的海藻酸钠溶液。待冷却到45℃后，加入10 m g游离酶，充分搅拌均匀后，用5号注射器滴入到100 m L质量分数为3%的CaC l2溶液中，形成凝胶颗粒，35℃下静置固化1 h。滤出凝胶颗粒并保留滤液，凝胶颗粒用去离子水洗涤，抽滤后在4℃下保存。

1.2.2 酶解工艺流程

称取适量黄油→添加水和辅助底物→75℃，预杀菌20m in→降温至室温→添加适量脂肪酶→于设定温下进行水解一定时间→90℃灭酶10m in→添加适量蛋白酶→于设定温度下进行水解一定时间→90℃灭酶10m in

1.2.3 共固定化酶添加量对奶香基料品质的影响

分别往6个锥形瓶中加入10 g黄油作为底物，辅底物乳清粉添加量为黄油质量的12.5%，加水量为黄油质量的60%，置于恒温水浴锅中（75℃，20 m in）灭菌后，冷却至室温后再分别添加共固定化酶，添加量为黄油质量的0%，25%，50%，75%，100%，125%；置于恒温摇床中（35℃，150 r/m in）反应2 h。滤出固定化酶后3 000 r/m in离心15 m in，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，并对产生的香气进行感官评价。

1.2.4 共固定化酶的酶解时间对奶香基料品质的影响

分别往6个锥形瓶中加入10 g黄油作为底物，辅底物乳清粉添加量为黄油质量的12.5%，加水量为黄油质量的60%，置于恒温水浴锅中（75℃，20 m in）灭菌后，冷却至室温后再分别添加共固定化酶为黄油质量的100%，置于恒温摇床中（35℃，150 r/m in）反应2 h。滤出固定化酶后3 000r/m in离心15 m in，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，并对产生的香气进行感官评价。

1.2.5 共固定化酶的酶解温度对奶香基料品质的影响

分别往6个锥形瓶中加入10 g黄油作为底物，辅底物乳清粉添加量为黄油质量的12.5%，加水量为黄油质量的60%，置于恒温水浴锅中（75℃，20 m in）灭菌后，冷却至室温后再分别添加共固定化酶为黄油质量的100%，分别置于30，35，40，45，50，55℃的恒温摇床中150 r/m in反应2 h。滤出固定化酶后3 000 r/m in离心15 m in，取上层油相，测定酶解后黄油的酸价，并对产生的香气进行感官评价。

1.2.6 酸价测定

测定方法参考《动植物油脂酸值和酸度测定》（GB/T 5530－2005）。

1.2.7 酥性饼干的制作

选用优质原辅料，面粉∶糖∶油∶水∶膨松剂的比例为50∶15∶10∶6∶0.8。把称好的糖用按比例称量的水溶解，在盘中把油用电动搅拌器高速搅拌30 s，加入称量好的面粉和膨松剂，把溶解好的糖水倒入，用手揉匀，加入面粉重量0.25%的奶香基料，用手揉匀，辊压到大概5 mm的厚度，用模子印出饼干形状，放入烤箱150℃烤制30 m in即可，同时制作不添加奶香基料的饼干作为空白对照。

1.2.8 感官评价

选定若干个人组成感官评价鉴定小组，按表1分别对酶解产物的香气强度、香气纯度和留香情况进行评分，评分结果为3者之和，总分为10。评分标准如表1所示。

2 结果与分析

2.1 共固定化酶添加量对奶香基料品质的影响

酶催化生成奶香香基时，酶的添加量对香基的风味影响较大。酶的添加量较少时，生成的风味物质的量少，奶香味较淡；酶添加量过多时，虽可产生大量的风味物质，却会产生某些不良气味，同时也会增加生产成本[8]。因此，应选择合适的共固定化酶添加量。

由图1和表2可知，当共固定化酶添加量小于黄油质量的100%时，随着共固定化酶的增加，产香效果越好，香气越浓郁。共固定化酶等于黄油质量的100%时，所得到的奶香香基为甜香型奶味，香气浓郁、圆润且回味悠长，此时测得酸价为1.86 m g/g。当共固定化酶添加量大于黄油质量的100%时，开始产生酸臊味，且随着加酶量的增加，奶香香基的酸价增加较快，酸臊味越来越严重。综合考虑，最适宜的共固定化酶的添加量为黄油质量的100%。

表1 香气评分标准

图1 共固定化酶添加量对奶香基料品质的影响

表2 共固定化酶添加量对奶香基料的感官影响

2.2 共固定化酶的酶解时间对奶香基料品质的影响

为了得到最好的效果和提高生产效率，选择合适的酶解时间也是很重要的。就理论而言，酶解时间越长，酶解反应越彻底。事实上，过长的酶解时间会生成较多的不良风味物质，影响香基的整体风味。但是当酶解时间过短时，酶解反应不完全，风味物质生成过少，风味没有充分形成。要香基达到理想的风味，酶解反应时间应控制好[8]。

图2 共固定化酶的酶解时间对对奶香基料品质的影响

表3 酶解时间对奶香基料的感官影响

从图2和表3可以看出，酶解产物的酸价随着酶解时间的增加而增大。当酶解时间是2 h时，产香效果最好，所得奶香香基香气浓郁、圆润，并与奶甜味协调，留香时间长，此时酸价为1.70 m g/g。当酶解时间超过2 h后，酸价继续上升，开始出现酸败味，感官评分下降，可能是黄油的酶解程度过高导致酶解产物中不良风味物质生成。综合考虑，选择酶解最适宜的时间为2 h。

2.3 共固定化酶的酶解温度对奶香基料品质的影响

酶对温度较为敏感,温度的不同会影响到酶活性中心的分子构象分布及底物黄油的乳化状态，从而影响到整个酶解反应的进程。当酶解温度低于最适温度时，温度会抑制酶的活性，使酶活力较低，同时也会影响底物的黏度，进而影响传质速度，酶解反应的速度变慢。当酶解温度高于最适温度时，由于高温会导致酶变性而减弱甚至失去催化活性[9]，而且在较高温度下共固定化酶外层的海藻酸钙会软化，使包埋在其中的酶泄漏出来，酶活力下降。

图3 共固定化酶的酶解温度对酸价和感官评分的影响

表4 酶解温度对奶香基料的感官影响

由图3和表4可以看见，当酶解温度低于40℃时，随着温度的升高，奶香香基的香气越来越强烈，香气纯度越来越协调、丰富，原因可能是温度的升高促进了酶解反应的进行，风味产物也随之增加。当温度达到40℃时，所得到的奶香香基的感官评分最高，此时的香基奶香是偏奶酪的奶香，奶香较强，香气较纯正圆润，留香时间长，所测得酸价是1.58 m g/g。当酶解温度达到45℃时，酶解产物的酸价最高，酸价是3.58 m g/g，感官评分降低，可能是因为酶解过度产生不良风味物质。酶解温度超过45℃时，可能是由于酶解温度高于最适温度导致酶变性而减弱甚至失去催化活性，或者是因为共固定化酶外层的海藻酸钙因为温度的升高而软化，使包埋在其中的酶泄漏出来，使酶活力开始下降导致酸价和感官评分降低。综上所述，适宜酶解温度是40℃。

2.4 奶香基料的应用试验

为了检测所制备的奶香基料的耐热性、和持香性，将奶香基料应用于饼干。

表5 饼干应用试验

如表5所示，不添加奶香基料的饼干，味道较单调，吃起来只有面粉味；而添加了奶香基料的饼干，能品尝到较明显的类似奶酪的奶香味，奶香浓郁，更能引起人的食欲，且饼干放置一周后仍带有奶香味。

可见，所制备的奶香基料不仅奶香浓郁，还具有良好的耐热性和持香性。

2.5 游离酶与共固定化酶制备奶香基料的比较

虽然固定化酶技术解决了游离酶的生产成本高等问题，但由于酶分子从游离态变成牢固态结合于载体时，酶分子的微观环境发生了变化[10]。因此游离酶和共固定化酶制备的奶香基料在工艺条件和感官评分方面还是存在一些差别。

表6 游离酶与共固定化酶制备奶香基料的条件比较

由表6可知，采用游离酶和共固定化酶所制备的奶香基料的香型都是奶酪香，香气醇正圆润，留香时间长，利用共固定化酶所得的奶香基料的香气浓度稍逊一筹，可能是海藻酸钠凝胶颗粒在一定程度上妨碍了酶和底物的接触，使某些呈味物质生成较少或无法生成，造成香气强度稍弱。但是共固定化酶的酶解时间更短，而且还可重复使用，大大节约了时间成本和原材料成本。