非小细胞肺癌组织裸鼠皮下成瘤性与原发肿瘤临床病理特征的关系

徐谊 唐诗聪 周鑫 徐祥 黄耀元 王守峰 潘泓

人源性肺癌组织移植瘤模型是目前常用的移植瘤模型，该模型的移植瘤与原发肿瘤在组织学形态、免疫组织化学以及基因表型上可保持一致，可高度模拟人体内环境，有利于研究肿瘤与间质的相互作用、筛选新型的肿瘤治疗药物及药物疗效评价，为肺癌患者提供个体化治疗［1］。但目前非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）人源性移植瘤（patientderived xenografts，PDX）模型成瘤率较低，成本较高，每个样本需移植大量受体鼠，且制备时间长，需观察2～16个月才能判断模型是否成功［2］。本研究探讨NSCLC组织在裸鼠皮下PDX模型的成瘤性，并分析其与原发肿瘤临床病理特征的关系，以期在构建NSCLC PDX模型前或构建模型过程中筛选合适的癌组织，提高成瘤率。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 NSCLC组织标本 随机选取广西医科大学附属肿瘤医院胸外科2016年7月至2017年1月经手术切除的15例原发性NSCLC组织，均为初诊且经病理学检查明确诊断，术前未行放化疗，其中腺癌7例、鳞癌6例、大细胞癌2例；低分化6例、中分化6例、高分化3例。所有组织标本均在手术中无菌获取。本研究获广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.1.2 实验动物和试剂 裸鼠购自广西医科大学动物实验中心，4～6周龄，体重 18～22 g，在SPF级条件下饲养。实验所需HBSS缓冲液和胎牛血清购自Invitrogen公司，人源和鼠源目的基因引物及人源、鼠源β-actin内参均购自广西科迪试剂公司。鼠抗人Ki-67、p63、细胞角蛋白 5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）和甲状腺转录因子-1（thyoid transcription factor-1，TTF-1）即用型单克隆抗体（一抗）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（二抗）、SP检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCLC PDX模型的建立 本课题组前期研究已成功构建NSCLC PDX模型，具体实验步骤见前期报道［3-4］。同时收集15例移植瘤模型对应患者的年龄、性别等一般情况以及原发肿瘤的病理类型、分化程度、TNM分期等临床病理资料。

1.2.2 免疫组织化学法检测TTF-1、p63、CK5/6、Ki-67蛋白的表达 NSCLC PDX模型对应的NSCLC患者原发肿瘤组织以4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，分别进行常规HE染色和免疫组织化学法染色。免疫组织化学法染色采用SP两步法：切片脱蜡至水；高压热修复，自然冷却；置于3%H2O2溶液10 min，灭活内源性过氧化物酶；PBS清洗2 min×3次，分别滴加鼠抗人Ki-67、p63、CK5/6和TTF-1单克隆抗体，置于4℃冰箱过夜；PBS清洗2 min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃温箱内培养 20 min；PBS清洗 2 min×3次，DAB 显色；蒸馏水冲洗，苏木精对比染色细胞核，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。以PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照为已知阳性的标本。

1.2.3 结果判定 TTF-1、Ki-67和p63蛋白均定位于细胞核，CK5/6定位于细胞质，阳性染色均呈（棕）黄色颗粒。免疫组织化学法染色结果由2位病理科医师采用双盲法观察每张切片，定性分析患者肿瘤组织中TTF-1、Ki-67、p63和CK5/6的表达情况。以肿瘤细胞增殖最旺盛的5个高倍视野（×400）计数阳性细胞百分比。当肿瘤细胞阳性表达小于10%且没有局灶区域呈阳性表达时记为阴性；肿瘤细胞阳性表达大于10%记为阳性；细胞几乎全部表达阴性但局灶区域呈强阳性表达记为局灶阳性，局灶阳性亦归为阳性［5］。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。采用独立样本t检验比较成瘤组和未成瘤组所对应肿瘤组织患者的年龄、肿瘤大小等；采用fisher确切概率法比较两组肿瘤组织的分化程度、TNM分期和Ki-67、TTF-1、p63、CK5/6表达率。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC PDX模型成瘤性与对应患者临床病理特征的关系

15例NSCLC组织在裸鼠皮下移植后成瘤6例，成瘤率为40%。分析成瘤性与对应患者主要临床病理特征的关系，结果显示，NSCLC PDX模型成瘤性与对应患者的TNM分期和肿瘤分化程度相关（P＜0.05），但与患者年龄、性别、吸烟情况、肿瘤大小以及组织学类型等无关（P＞0.05）。见表1。

2.2 NSCLC PDX模型对应NSCLC组织中p63、TTF-1、CK5/6和Ki-67蛋白的表达

对应NSCLC组织的HE及免疫组化染色结果（图1）显示，TTF-1蛋白定位于细胞核，阳性染色呈（棕）黄色颗粒，成瘤组TTF-1蛋白阳性表达率高于未成瘤组（83%vs 22%，P=0.041）；p63蛋白定位于细胞核，阳性染色呈（棕）黄色颗粒，成瘤组中p63蛋白阳性表达率低于未成瘤组（50%vs 100%，P=0.041）；CK5/6定位于细胞质，阳性染色呈（棕）黄色颗粒，成瘤组中CK5/6蛋白阳性表达率与未成瘤组差异无统计学意义（33%vs 44%，P=0.315）；Ki-67蛋白定位于细胞核，阳性染色呈（棕）黄色颗粒，成瘤组中Ki-67蛋白阳性表达率高于未成瘤组（100%vs 22%，P=0.007），见表2。

表1 NSCLC PDX模型成瘤性与对应患者临床病理特征的关系［n（%）］

表2 NSCLC PDX模型对应NSCLC组织中p63、TTF-1、CK5/6和Ki-67蛋白的表达［n（%）］

图1 对应NSCLC组织中p63、TTF-1、CK5/6和Ki-67蛋白的表达（HE 染色，×400）

3 讨论

肺癌裸鼠移植瘤模型的原位移植及肾包膜下移植均有较高的成瘤率，但这两种方法均需熟练操作，且肉眼难以直视观察成瘤情况，不利于推广［3，6］。本研究采用的裸鼠皮下移植成瘤是目前常用的建模方法，成瘤率为20%～40%。本课题组前期研究［3-4］已证明，采用此方法建立的移植瘤模型在生物学特性上可与原肿瘤保持一致性。Perez-Soler等［7］将100例肺癌组织接种于裸鼠皮下，建模成功率为34%。Fichtner等［8］将102例肺癌组织接种于NOD/SCID祼鼠皮下，建模成功率为24.5%。本研究15例NSCLC组织在裸鼠皮下移植后成瘤6例，成瘤率为40%，与上述报道的成瘤率相当，提示采用此法建模正确，成功率较高。

文献报道，NSCLC组织在裸鼠皮下成瘤性与原发肿瘤自身侵袭性和恶性程度相关，且移植成瘤对应的患者易复发，预后较差［9］。本研究比较成瘤组与未成瘤组对应患者的临床病理特征，发现分期较高及肿瘤分化程度较低的NSCLC组织更易成瘤，提示NSCLC PDX模型成瘤率可能与原发肿瘤的侵袭性及恶性程度相关。

TTF-1又称甲状腺特异性增强子结合蛋白，是一种在甲状腺、肺和间脑早期发育过程中表达的组织特异性转录因子，参与调控多种基因表达，亦是评价NSCLC侵袭性的有效指标［10］。Ki-67作为标记细胞增殖状态的抗原，近年已广泛用于肿瘤细胞增殖活性研究，与其他标记细胞增殖活性的方法相比，标记Ki-67抗原更简单、可靠和准确。罗朋等［11］研究发现Ki-67高表达的肿瘤组织易移植成瘤。p63常表达于上皮组织基底层，在正常上皮组织的形成中发挥重要作用。p63基因在结构上与p53基因具有高度同源性，是p53基因家族的一员。研究发现p63表达与肺癌侵袭性和转移性等生物学特性相关［12］。本研究探讨NSCLC PDX模型成瘤性与对应来源NSCLC癌组织中TTF-1、p63、CK5/6、Ki-67蛋白表达的关系，发现成瘤组TTF-1和Ki-67蛋白表达水平明显高于未成瘤组，推测TTF-1、Ki-67可能是原癌基因，通过调节TTF-1、Ki-67表达促进NSCLC细胞增殖、侵袭，从而更易在裸鼠体内成瘤。然而p63表达水平明显低于未成瘤组，提示p63可能是抑癌基因，其低表达可能与NSCLC发生和发展有关，但具体机制尚未清楚。研究发现CK5/6阳性表达在肿瘤体积更大或邻近组织受累范围更大时显著升高，而淋巴结转移程度越高阳性表达越低，认为CK5/6可能与肿瘤生长、浸润及淋巴结转移有关［12］。但本研究未发现成瘤组和未成瘤组CK5/6表达的差异性，可能与样本量不足有关。

综上，本研究发现分期较高和肿瘤分化程度较低的NSCLC组织在裸鼠皮下更易成瘤。因此，在构建PDX模型前或构建过程中，应综合原发肿瘤分期、分化程度及TTF-1、Ki-67、p63的表达情况，筛选合适的NSCLC组织，以提高成瘤率。但本研究样本量较小，有关结论仍待进一步证实。

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