同时蒸馏萃取制备延药睡莲精油及其抗氧化研究

2018-06-19范杨杨王健余文刚吉浩鹿文举柏宝冰赵莹宋希强

食品研究与开发 2018年12期

范杨杨，王健，余文刚，吉浩，鹿文举，柏宝冰，赵莹，宋希强

（海南大学热带农林学院/环南海陆域生物多样性研究中心，海南海口570228）

睡莲属（Nymphaea）为睡莲科（Nymphaeaceae）多年生水生草本植物，在温带及热带地区都有广泛种植。睡莲属植物含有多种类型化合物，例如黄酮、多糖及生物碱等。从睡莲属植物中共分离得到的黄酮类及酚酸类化合物70余个，分别为黄酮、黄酮醇及异黄酮类[1]。根据对睡莲的营养成分分析，结果表明睡莲富含17种氨基酸，睡莲蛋白属优质蛋白。分析结果还表明睡莲含有丰富的VC、黄酮甙、微量元素锌，这二者配合具有很强的排铅功能[2]。

延药睡莲（Nymphaea stellata），又名蓝药睡莲、延药睡莲，花大型，挺水开放，花瓣上部为美丽的深蓝色，中下部淡蓝色，花开呈星状，有香气，观赏价值极高，是良好的切花花材。延药睡莲原产于印度及东南亚，据《海南植物志》记载我国仅在海南省万宁市境内的丘陵湿地中及海口市附近发现有自然分布[3]。延药睡莲具有广泛的药用价值，根茎的粉末可用于治疗腹泻，其浸出物作为一种润滑剂和利尿剂，用于淋病及尿道感染的治疗。其制成物可缓解咳嗽症状，并对胆病，呕吐，眼花等有一定疗效[4-5]。现代研究表明，延药睡莲在食品工业及医药卫生行业具有广阔的应用前景。

同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）是通过同时加热样品液相与有机溶剂至沸腾来实现的，水蒸气和溶剂蒸气同时在仪器中被冷凝下来，水和溶剂不相混溶，在仪器U形管中被分开来，分别流向两侧的烧瓶中，结果蒸馏和提取同时进行，只需要少量溶剂就可提取大量样品，香气成分得到浓缩。该方法可以避免长时间高温加热带来的负面影响。本文使用同时蒸馏萃取方法提取延药睡莲精油，并分析几种不同因素对精油提取率的影响，并用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对精油进行成分分析，还对其体外抗氧化性初步研究。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

延药睡莲：海南荣丰花卉有限公司；氯化钠、无水硫酸钠、二氯甲烷、BHT、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）、磷酸缓冲液（（phosphate buffer saline，PBS）、六氰合铁（Ⅲ）酸钾、三氯乙酸：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅（HH-4）：金坛市盛蓝仪器制造有限公司；旋转蒸发仪（RV10）：九方沃德科技发展有限公司；GC/MS联用仪（HP6890/5975C）：美国安捷伦公司；多管架自动平衡离心机（TDZ5-WS）：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；紫外可见分光光度计（T52N）：上海佑科仪器仪表有限公司。

2 方法

2.1 延药睡莲前处理

将延药睡莲花瓣解离，在50℃下干燥10 h后，进行粉碎，过60目筛得到延药睡莲花瓣粉末。

2.2 不同因素对同时蒸馏萃取法制备延药睡莲精油得率的影响

2.2.1 NaCl含量对延药睡莲精油得率的影响[6-7]

准确称取30 g延药睡莲花瓣粉末，放置于1L烧瓶中，依次用600 mL 0%、5%、10%、15%、20%NaCl溶液浸泡花瓣粉末，静置浸泡4 h，将其安装于同时蒸馏萃取装置的左端，用电热套加热至其沸腾；将100 mL二氯甲烷装入500 mL的烧瓶，接入同时蒸馏萃取装置的右端，用恒温水浴锅加热至50℃使其沸腾。同时蒸馏萃取2 h后，取下右端装有二氯甲烷的烧瓶，加入无水硫酸钠进行干燥，旋转蒸发除去有机试剂，得到精油产物，计算精油得率/%=精油质量/30×100。

2.2.2 蒸馏时间对延药睡莲精油得率的影响

准确称取30 g延药睡莲花瓣粉末，放置于1 L烧瓶中，用600 mL 10%NaCl溶液浸泡花瓣粉末，按照

2.2.1 操作步骤，依次同时蒸馏萃取 1、2、3、4、5 h 后，计算精油得率。

2.2.3 料液比对延药睡莲精油得率的影响

准确称取30 g延药睡莲花瓣粉末，依次用料液比分别为 1∶10、1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）的含 10%NaCl水溶液浸泡花瓣粉末，按照2.2.1操作步骤，计算精油得率。

2.3 GC-MS分析延药睡莲精油成分

样品加二氯甲烷溶解后浓缩至尽干，进样1 μL。色谱 FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，柱温48℃，保持2 min，以4℃/min升温至220℃，以10℃/min升温至310℃，保留4 min，运行时间58 min；汽化室温度250℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压48 676.9 Pa，载气流量1.0 mL/min；分流比：20 ∶1；溶剂延迟时间：5 min。

离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 624 V；接口温度 280℃；质量范围 29 amu～450 amu。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2005和Wiley275标准质谱图，确定了挥发性化学成分，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数。

2.4 延药睡莲精油的体外抗氧化活性初步研究2.4.1 清除DPPH自由基测定

用二氯甲烷溶液分别配制浓度为2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的睡莲精油溶液，2.0 mg/mL的BHT溶液作为样品溶液。分别将2.0 mL样品溶液和2.0 mL浓度为1.0×10-4mol/L的DPPH溶液，混匀后暗处放置0.5 h，以二氯甲烷作参比，测定517 nm处的吸光值A，同样测定2.0 mL样品溶液与2.0 mL二氯甲烷混合后517 nm处的吸光值A0，再测定2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL二氯甲烷混合液在517 nm处的吸光值A1，按下式公式计算清除率[8-9]：

2.4.2 清除2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS+）自由基测定

配制2 mmol/L ABTS溶液，吸取50 mL上述溶液与200 mL K2S2O8溶液（70 mmol/L）混合，暗处放置 12 h，得到ABTS+自由基溶液。用磷酸缓冲液（PBS）将ABTS+自由基溶液稀释至在734 nm下吸光度为0.70±0.02。用二氯甲烷溶液分别配制浓度为2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的睡莲精油溶液，2.0 mg/mL的BHT溶液作为样品溶液，按下式公式计算清除率[10]：清除率/=（A0-A）/A0，式中：A0为ABTS+自由基溶液的吸光度；A为加睡莲溶液后的吸光度。

3 结果与分析

3.1 不同因素对同时蒸馏萃取法制备延药睡莲精油得率的影响

3.1.1 NaCl含量对延药睡莲精油得率的影响

NaCl含量对延药睡莲精油得率的影响见图1。

由图1可知，随NaCl含量的增加精油得率会先增加后降低，NaCl含量在5%～15%时，精油得率提取量较高；当NaCl含量大于10%后，精油得率会有所下降。在溶液中加入NaCl会产生盐析效应，加速精油析出。然而，随着盐浓度的增加，水溶液的沸点也会随之增加，过高的温度会引发一些热稳定性差的化合物分解，导致精油得率下降[11-12]。

3.1.2 蒸馏时间对延药睡莲精油得率的影响

蒸馏时间对延药睡莲精油得率的影响见图2。

图1 精油得率随NaCl含量的变化Fig.1 The change of yield of essential oil with the content of NaCl

图2 精油得率随蒸馏时间的变化Fig.2 The change of yield of essential oil with the distillation time

图2结果表明，随蒸馏时间的增加精油得率整体是增加的趋势，达到4 h后，得率随蒸馏时间增加而出现减少的趋势。原因可能是因为温度过高使得精油被破坏或者分解。并且，随着蒸馏时间增长可能会伴随副产物的产生，不但造成资源浪费，还会影响延药睡莲精油的品质[13-15]。

3.1.3 料液比对延药睡莲精油得率的影响

料液比对延药睡莲精油得率的影响见图3。

图3 精油得率随料液比的变化Fig.3 The change of yield of essential oil with material liquid ratio

从图3结果可看出，料液比达到1∶20（g/mL）后，得率不再随料液比的增加而增加，而是出现减少的趋势。原因可能是当料液比为1∶20（g/mL）时，随着溶液体积进一步增加，延药睡莲花瓣在NaCl溶液中已经接近饱和，精油在水中的溶解量不会再增加[16-18]。

3.2 GC-MS分析延药睡莲精油成分结果

GC-MS分析延药睡莲精油成分结果见图4和表1。

图4 总离子流图Fig.4 Total ion flow graph

表1 延药睡莲精油成分表Table 1 List of essential oil components of Nymphaea stellata

由表1可见，水蒸气蒸馏萃取法得到的延药睡莲精油的主要成分有2-十七烷酮（32.573）、二十三烷（13.999）、叶绿醇（四甲基-2-十六碳烯-1-醇）（10.123）、6（Z），9（E）-十七碳二烯酸（3.821）和二十五烷（3.719）。从化合物的种类来看，主要是一些羰基类化合物如2-十七烷酮，饱和烷烃如二十三烷、二十五烷，还有烯烃类化合物如叶绿醇、6（Z），9（E）-十七碳二烯酸。

3.3 延药睡莲精油的抗氧化活性测定结果3.3.1 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基清除率的测定结果见图5。

图5 延药睡莲精油对DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of Nymphaea stellata essential oil to DPPH free radical

图5表明延药睡莲精油对DPPH自由基存在清除能力，并且随着精油量的增加，对DPPH的清除率也会随之增加。气质联用分析结果表明，延药睡莲精油中含有较多的羰基类化合物和烯烃类化合物。随着延药睡莲精油浓度的增大，上述两种物质也会随之增多。由此可推断，可能是羰基类化合物和烯烃类化合物，对DPPH自由基有清除作用[19]。浓度为2.0 mg/mL的睡莲精油对DPPH自由基的清除率比同一浓度的BHT要低，说明延药睡莲精油对DPPH自由基的清除率要比抗氧化剂BHT弱。

3.3.2 ABTS+自由基清除率的测定

ABTS+自由基清除率的测定见图6。

图6 延药睡莲精油对ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of Nymphaea stellata essential oil to ABTS+free radical

从图6可看出，延药睡莲精油对ABTS+自由基存在清除能力，并且随着精油量的增加，对ABTS+自由基的清除率也会随之增加。浓度为2.0 mg/mL的睡莲精油对ABTS+自由基的清除率达1.79%，而浓度为2.0mg/mL的BHT对ABTS+自由基的清除率达36.74%。因此，延药睡莲精油对ABTS+自由基的清除率要比抗氧化剂BHT弱。

4 结论

使用同时蒸馏萃取法（SDE）制备了延药睡莲精油，并采用GC-MS手段鉴定样品中所含的化学成分。确定了SDE法提取精油的最佳工艺参数：10%NaCl含量、蒸馏时间为 2 h、料液比 1 ∶20（g/mL）、蒸馏温度为50℃，在上述提取条件下，延药睡莲精油的得率可以达到0.101%。SDE法制备的延药睡莲精油含有较多的羰基类化合物，并且所得精油具有一定的体外抗氧化性。

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