尖锐湿疣皮损组织HBD-2、HBD-3、Bcl-2表达变化及意义

欧伟洪，陈晓东

(中南大学湘雅医院附属海口医院，海口570208)

尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒(HPV)感染所致的性传播疾病，其发生、发展的具体机制尚未完全阐明[1,2]。尖锐湿疣好发于肛门及外阴，初期可出现淡红色丘疹，并逐渐转化为菜花样、乳头瘤样等赘生物，持续进展可出现溃疡、继发感染等。防御素是一类可杀死细菌、真菌或者病毒等微生物并有抗肿瘤活性的多肽。人β防御素2(HBD-2)、HBD-3作为抗菌肽，能够与机体发生间接或直接的免疫防御反应，抑制并杀灭病原菌，其过度表达与多种皮肤病的发生有关[3～5]。B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)基因能够调控肿瘤相关胞嘧啶及移植抗原启动子序列，并于活化增殖细胞中大量转录，其高度表达能够影响抗癌药物活性[6]。本研究探讨尖锐湿疣皮损组织HBD-2、HBD-3、Bcl-2表达变化及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年3月～2017年3月中南大学湘雅医学院附属海口医院收治的尖锐湿疣患者165例(观察组)，男85例、女80例，年龄20～60(33.41±7.65)岁，病程0.5～4(1.53±0.74)个月；均给予皮损部位液氮冷冻治疗，将全部疣体皮损清除，并外用康复新液，持续使用1个月。入选标准：符合尖锐湿疣诊断标准[7]，外阴均有明显的皮损；入组前均未接受免疫抑制剂、糖皮质激素等治疗。排除标准：艾滋病及梅毒血清学检查提示阳性；肝肾功能损伤；结核病、银屑病史；妊娠及哺乳期妇女。选择同期收治的165例皮肤健康志愿者为对照组，均无皮肤病变史，年龄21～58(31.93±7.94)岁，其中男81例，均进行包皮环切术；女84例，均进行性器官美容整形手术。两组年龄、性别具有可比性。

1.2 皮损组织HBD-2、HBD-3、Bcl-2表达检测 采用免疫组织化学法。观察组分别于治疗前及治疗结束时收集皮损组织标本，女性主要选择阴道及大小阴唇等部位疣体组织，男性主要选择肛周及阴茎等部位疣体组织。对照组男性标本为包皮环切术后的正常包皮，女性标本为性器官美容整形患者的健康外阴组织。将标本制作为蜡块并切片，脱蜡至水。室温下以3%过氧化氢浸泡15 min，采用蒸馏水冲洗，并以磷酸盐缓冲液浸泡3次；将切片进行热抗原修复，反复冲洗3次，滴加5% BSA封闭，室温下孵育20 min；加入HBD-2、HBD-3、Bcl-2一抗工作液(浓度均为1∶300)，于4 ℃冰箱过夜；次日取出标本，于室温下放置30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，加入生物素化二抗工作液，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗3次，加入链霉亲和素复合体，37 ℃孵育20 min；PBS冲洗3次，加入3,3-二氨基联苯胺并避光显色，于显微镜下查看染色情况，并控制反应时间，及时终止反应；自来水冲洗后，复染、脱水、透明并封片。在光学显微镜下观察，选择MIAS2000图像分析系统，统计HBD-2、HBD-3阳性区域平均光密度(MOD)值及Bcl-2表达阳性率。HBD-2阳性判定标准：以镜下细胞质出现棕黄色颗粒为阳性；HBD-3阳性判定标准：以镜下细胞质出现红色颗粒为阳性。Bcl-2定位于细胞质内，以出现棕褐色至淡黄色颗粒样物质为阳性。

2 结果

2.1 两组皮损组织HBD-2、HBD-3、Bcl-2表达比较 见表1。

表1 两组皮损组织HBD-2、HBD-3、Bcl-2表达比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与同组治疗前比较，#P<0.01。

2.2 尖锐湿疣患者皮损组织HBD-2、HBD-3表达和Bcl-2表达的相关性 尖锐湿疣患者皮损组织HBD-2、HBD-3表达与Bcl-2表达均呈正相关(r分别为0.709、0.680，P均<0.05)，HBD-2与HBD-3表达呈正相关(r=0.671，P<0.05)。

3 讨论

尖锐湿疣好发于性活跃阶段，宿主免疫缺陷时易诱发HPV感染，但大部分免疫正常者宿主感染HPV后可痊愈，说明可通过增加免疫应答反应以抵抗HPV感染[11]。

抗菌肽为天然黏膜及表皮免疫的主要成分，具有抗肿瘤、抗真菌、抗病毒等生物活性。HBD-2及HBD-3能够参与抗菌肽的形成，属于β防御素，能够在多种细胞因子诱导下生成，主要于角质形成细胞及上皮细胞中表达，共同调控机体天然免疫系统[12]。研究发现，银屑病角质形成细胞中HBD-2及HBD-3表达明显升高，皮肤、口腔黏膜等组织中均有二者的表达[13]；尖锐湿疣患者皮损组织HBD-2及HBD-3表达明显高于正常皮肤组织[14]。本研究结果显示，观察组治疗前皮损组织HBD-2及HBD-3表达升高，且治疗后HBD-2及HBD-3表达低于治疗前。说明局部HPV感染能够刺激免疫反应，从而促进HBD-2及HBD-3表达；经治疗HPV感染被控制，HBD-2及HBD-3表达降低。提示HBD-2及HBD-3可能参与了尖锐湿疣的发生，二者表达变化可反映疾病的转归。

Bcl-2为凋亡抑制基因，主要于细胞中线粒体核膜、外膜及粗面内质网上表达，其过度表达可抑制多种因素所致的细胞凋亡，促进细胞增殖。研究发现，在多种凋亡细胞中Bcl-2表达明显下降[15]。邢春瑶等[16]报道，Bcl-2过表达能够抑制细胞凋亡，其可通过特定通路调控皮损组织细胞凋亡，导致细胞凋亡与增殖失衡，引发疾病。本研究观察组皮损组织中Bcl-2表达明显高于对照组，提示Bcl-2高表达可抑制皮损组织细胞凋亡，促进该病的发生及进展；经治疗Bcl-2表达明显下调，可能与疾病经治疗后细胞凋亡的异常调控得到纠正有关[17]。本研究进一步发现，尖锐湿疣患者HBD-2、HBD-3、Bcl-2三者两两表达均呈正相关，说明三者之间可能存在一定相互作用。推测机体感染HPV后能够诱导HBD-2、HBD-3、Bcl-2大量表达，促进疾病发生、发展。

综上所述，尖锐湿疣皮损组织HBD-2、HBD-3、Bcl-2表达均上调，三者表达变化参与尖锐湿疣的发生并可反映疾病转归。

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