下肢动脉硬化闭塞症患者PECAM-1基因多态性与支架植入术后再狭窄的关系

左江伟，郭思恩，王斌强，韦涌初

(1广西医科大学第三附属医院 南宁市第二人民医院，南宁530031；2广西医科大学第一附属医院)

下肢动脉硬化闭塞症(AOD)的病理基础是动脉壁粥样硬化[1]。球囊扩张和支架植入是目前临床上治疗AOD的常用方法，能够迅速疏通闭塞血管，但术后再狭窄发生率较高[2,3]。血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)是成熟血管内皮细胞特异性表达的分子之一，可作为血管内皮细胞标志物[4]。近年研究发现，PECAM-1基因多态性与动脉粥样硬化关系密切。PECAM-1基因第3外显子LeuI25Val和第8外显子Asn563Ser已被证实与细胞黏附及跨内皮迁移有关[5,6]。本研究探讨AOD 患者PECAM-1 LeuI25Val和Asn563Ser基因多态性与支架植入术后再狭窄的关系。

1 临床资料

1.1 基本资料 选择2013年6月～2014年12月广西医科大学第三附属医院和广西医科大学第一附属医院收治的AOD患者233例，均行球囊扩张+支架植入治疗。其中，男139例、女94例，年龄45～85(66.4±7.6)岁，FontaineⅠ期51例、Ⅱ期55例、Ⅲ期65例、Ⅳ期62例，合并高血压49例、冠心病114例、高脂血症68例、糖尿病37例。纳入标准：①既往病史、临床查体、影像学检查等临床病理资料齐全；②随访时间为3年；③保留血液样本。排除标准：①血液系统疾病；②免疫系统疾病；③良恶性肿瘤；④术后1月内发生闭塞；⑤未能按约定完成随访或随访期间死亡。其中术后3年出现再狭窄者93例作为观察组，术后3年未出现再狭窄者140例作为对照组。观察组男56例、女37例，年龄(66.8±8.2)岁，FontaineⅠ期14例、Ⅱ期18例、Ⅲ期28例、Ⅳ期33例，合并高血压25例、冠心病60例、高脂血症38例、糖尿病22例；对照组男83例、女57例，年龄(66.3±7.5)岁，FontaineⅠ期37例、Ⅱ期37例、Ⅲ期37例、Ⅳ期29例，合并高血压24例、冠心病54例、高脂血症30例、糖尿病15例。观察组BMI、Fontaine Ⅳ期构成比以及合并冠心病、高脂血症和糖尿病构成比均高于对照组(P均<0.05)，其余资料比较P均>0.05。

1.2 血浆PECAM-1水平 两组均于入院检查时采集外周静脉血，EDTA抗凝，- 80 ℃超低温冰箱保存。冰上解冻后，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，分离血浆，采用ELISA法检测血浆PECAM-1，操作步骤严格按照试剂盒说明进行。结果显示，观察组与对照组血浆PECAM-1水平分别为(73.6±18.4)、(93.5±22.4)ng/mL，两组比较P<0.01。

1.3 PECAM-1基因多态性检测 ①DNA提取：采用DNA提取试剂盒(TAKARA)抽提血液样本的DNA，操作步骤主要包含菌体裂解、DNA与膜结合、DNA纯化等，均严格按照说明进行，所得DNA经琼脂糖凝胶电泳定量。② Leu125Val(373C/G)与Asn563Ser(1688T/C)提取：通过聚合酶链反应-限制性片断多态性(PCR-RFLP)技术提取PECAM-1基因的Leu125Val(373C/G)与Asn563Ser(1688T/C)，引物由TAKARA设计与完成。Leu125Val(373C/G)上游引物：5′-GCTCCATCTGCTTGCCTGT-3′，下游引物：5′-TCTCAGCACCACCTCTCACG-3′。Asn563Ser(1688T/C)上游引物：5′-TGGAGACCCTGACTCACCTC-3′，下游引物：5′-TGCAATGTGCTGTGAATGAA-3′。③酶切与鉴定：采用限制性内切酶酶切所得基因后再次进行琼脂糖凝胶电泳，Leu125Val(373C/G)的变异产物被切为188 bp和37 bp两个片段，野生纯合子CC为225 bp，杂合子CG为225 bp+188 bp+37 bp，突变纯合子GG为188 bp+37 bp；Asn563Ser(1688T/C)的变异产物被切为217 bp和121 bp两个片段，野生纯合子TT为338 bp，杂合子TC为338 bp+217 bp+121 bp，突变纯合子CC为217 bp+121 bp。结果显示，观察组Leu125Val基因G基因型和突变纯合子GG频率高于对照组，C基因型和野生纯合子CC频率低于对照组；Asn563Ser基因C基因型和突变纯合子CC频率高于对照组，T基因型和野生纯合子TT频率低于对照组；组间比较P均<0.05。见表1。

表1 两组PECAM-1 Leu125Val与Asn563Ser位点等位基因和基因型频率比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05。

1.4 AOD术后3年再狭窄的危险因素分析 将BMI、Fontaine分期、冠心病、高脂血症、糖尿病、血浆PECAM-1水平、PECAM-1 Leu125Val与Asn563Ser基因多态性一并纳入Logistic回归分析。结果显示，Fontaine分期Ⅲ、Ⅳ期及冠心病、高脂血症、糖尿病、血浆PECAM-1水平<88.4 ng/mL、PECAM-1 Leu125Val GG突变和Asn563Ser CC突变均为AOD术后3年再狭窄的危险因素(P均<0.05)。见表2。

表2 AOD术后再狭窄的危险因素的Logistic回归分析结果

2 讨论

目前临床治疗AOD主要借助于动脉重建或介入疗法恢复血管畅通。术后动脉再狭窄是影响患者预后的主要原因[7,8]。多数AOD患者发生再狭窄可能与下肢承受了人体主要重量有关。根据术后再狭窄的发生时间，将术后闭塞分为早期(术后1个月内)闭塞和中晚期闭塞，早期闭塞多为手术技巧问题或抗血小板药物使用不当，中晚期闭塞的主要原因是栓子形成和内膜增生，主要受两个因素影响：一是动脉粥样硬化，不稳定斑块脱落形成栓子和血管内膜增生；二是手术和支架对血管内皮的刺激[9,10]。球囊扩张过程本身会对血管内皮细胞造成损伤，另外血流自宿主动脉流经支架时顺应性的改变可能产生一定程度的机械应力，从而刺激吻合口血管内膜增生。

PECAM-1是一种细胞表面糖蛋白，属于细胞黏附分子免疫球蛋白超家族成员，高表达于血小板、血管内皮细胞及部分免疫细胞，主要介导内皮细胞之间、内皮细胞与其他细胞之间的黏附作用[11,12]。有研究已证实，动脉粥样硬化患者血浆PECAM-1水平偏低[13]。本研究发现AOD术后3年再狭窄患者血浆PECAM-1水平亦明显偏低。炎症细胞聚集并黏附于血管内皮细胞是动脉粥样硬化发生与发展的重要始动环节，该作用主要是通过细胞黏附分子来完成的，介导这一过程的细胞黏附分子有四类，各类黏附分子的功能不尽相同[14]。其中PECAM-1又称为CD31，几乎表达于成熟个体的所有血管内皮细胞，既是构成细胞膜的重要成分，也是连接内皮细胞组成成分，可直接参与血管床的构成[15]。因此，PECAM-1水平降低可能造成内皮细胞损伤，破环血管床的稳定性，诱发形成栓子及血管内膜增生。

PECAM-1基因多态性已被证实与动脉粥样硬化脑梗死和静脉血栓形成有关[16,17]，其是否关系到AOD血管支架植入术后再狭窄国内鲜见报道。目前，PECAM-1基因已发现11个单核苷酸多态性，其中3个被证实参与AOD的病理过程，包括Leu125Val(373C/G)、Asn563Ser(1688T/C)和Gly670Arg(2008G/A)。Leu125Val(373C/G)和Asn563Ser(1688T/C)可介导细胞间黏附作用及细胞跨内皮迁移，Gly670Arg(2008G/A)主要介导细胞内信号转导。本研究主要考察前两个位点的基因多态性。本研究结果显示，观察组Leu125Val基因G基因型和突变纯合子GG频率高于对照组，Asn563Ser基因C基因型和突变纯合子CC频率高于对照组，这与国内学者对动脉粥样硬化脑梗死的研究结果一致[18]。可能是由于脑梗死和AOD支架植入术后再狭窄具有相似的病理机制，即血栓形成和血管内膜增生。考虑到BMI、Fontaine分期、冠心病、高脂血症、糖尿病、血浆PECAM-1水平等也是AOD支架植入术后再狭窄的影响因素，本研究将各因素均纳入Logistic回归分析，发现Fontaine分期Ⅳ期、冠心病、高脂血症、糖尿病、血浆PECAM-1水平<88.4 ng/mL、PECAM-1 Leu125Val GG突变和Asn563Ser CC突变均为AOD术后3年再狭窄的独立危险因素。该结果说明排除各个因素间的相互影响与作用，Leu125Val GG突变和Asn563Ser CC突变仍能够增加AOD术后再狭窄的风险。

综上所述，PECAM-1 Leu125Val GG突变和Asn563Ser CC突变与AOD支架植入术后再狭窄有关。

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