STAT3抑制剂WP1066对卵巢癌SKOV3细胞凋亡和侵袭的影响及其机制

张自辉，梅梅，邓杰

(湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院，湖北襄阳441000)

卵巢癌易复发，且对化疗药物耐药率高，患者预后差，其病死率居妇科癌症的首位[1,2]。信号转导和转录激活因子(STAT)是一类通过二聚体/异二聚体的形式将细胞外信号传递到细胞内靶基因的转录因子[3,4]。其中STAT3对淋巴瘤、黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌等多种肿瘤细胞增殖、侵袭具有调控作用[5～7]，但其对卵巢癌发生、发展的影响报道较少。2016年8月～2017年10月，本研究观察了STAT3抑制剂WP1066对卵巢癌SKOV3细胞凋亡和侵袭能力的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3细胞株由中国科学院细胞库提供，WP1066购自美国Selleck Chemicals公司，兔抗人Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9抗体购自美国Santa Cruz公司，注射用顺铂购自山东齐鲁制药有限公司，FBS购自浙江天杭生物科技有限公司，McCoy′s 5A液体培养基购自武汉博士德生物工程有限公司。MTT 试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒由武汉赛维尔生物科技有限公司提供。

1.2 细胞培养及分组处理 SKOV3细胞用含10% FBS的McCoy′s 5A液体培养基培养，当细胞融合80%左右时，0.25%胰酶溶液(含0.02% EDTA)消化并传代。取对数生长期细胞随机分为空白对照组、WP1066组、顺铂组、联合组。空白对照组常规培养，WP1066组给予含终浓度5 μmol/L WP1066培养，顺铂组给予含终浓度5 μg/mL顺铂培养，联合组给予含终浓度5 μmol/L WP1066和5 μg/mL顺铂培养。培养48 h时，收集各组细胞，进行以下研究。

1.3 细胞凋亡率检测 将各组细胞2 000 r/min离心4 min，弃上清，PBS重悬，每管加入Annexin V-FITC结合液120 μL、Annexin V-FITC 3 μL、PI染色液5 μL，室温避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭实验。将各组细胞制成5×104个/mL单细胞悬液，取100 μL放入含有Matrigel的Transwell上室，下室加入含10% FBS的McCoy′s 5A液体培养基600 μL，继续培养24 h。取出Transwell小室，甲醛固定并结晶紫染色，200倍光镜下随机选取5个视野并拍照，计数每组微孔膜外层细胞数。

1.5 Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达检测 采用Western blotting法。采用BCA蛋白定量检测试剂盒测定各组细胞蛋白含量，上样Buffer并沸水浴4 min，然后行SDS-PAGE，5%脱脂奶粉封闭60 min，分别加入Survivin(1∶200稀释)、c-Myc(1∶500稀释)、BCL-2(1∶400稀释)、MMP-2(1∶500稀释)、MMP-9(1∶500稀释)一抗4 ℃孵育12 h，HRP标记羊抗兔抗体(1∶800稀释)孵育60 min，TBST洗膜3次，ECL显影，计算各蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡率比较 空白对照组、WP1066组、顺铂组、联合组细胞凋亡率分别为(4.87±0.38)%、(11.53±0.71)%、(10.07±0.67)%、(19.28±0.52)%。WP1066组、顺铂组、联合组细胞凋亡率均较空白对照组升高，联合组高于WP1066组、顺铂组，组间比较P均<0.05。

2.2 各组细胞侵袭能力比较 对照组、WP1066组、顺铂组、联合用药组细胞穿膜数分别为(84.3±12.7)、(54.7±10.4)、(48.7±14.2)、(22.1±10.9)个。WP1066组、顺铂组、联合组细胞侵袭能力均较空白对照组降低，联合组低于WP1066组、顺铂组，组间比较P均<0.05。

2.3 各组Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量比较 见表1。

表1 各组Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与WP1066组比较，▲P<0.05；与顺铂组比较，▼P<0.05。

3 讨论

目前在临床上卵巢癌的诊治面临几大难题，包括早期诊断困难、复发率高及化疗耐药等[8,9]。寻找有效且毒性更小的化疗药物以及分子靶点是目前临床研究的热点。研究表明，JAK2/STAT3通路在维持卵巢癌肿瘤干细胞功能方面具有重要作用，与肿瘤的起源、进展和维持密切相关[10]。WP1066作为STAT3抑制剂，可显著抑制STAT3磷酸化水平，在多种肿瘤中均表现出良好的抗肿瘤作用。本研究对体外培养的卵巢癌细胞分别给予WP1066、顺铂或两药联合处理，结果显示WP1066可促进SKOV3细胞凋亡、抑制其侵袭，效果与顺铂相当，且两药联合效果更好。

Survivin是凋亡家族抑制剂的成员，在抑制细胞凋亡和促进有丝分裂方面发挥重要作用[11]。Survivin在胎儿组织中广泛表达，在人体发育过程中表达受限，大多数正常成年组织中Survivin表达极低，但其在各种肿瘤包括卵巢癌中高表达[12]。卵巢癌组织或细胞中Survivin高表达可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，并参与化疗药物耐药、肿瘤转移和复发[13～16]。CyclinD1是一种细胞周期调节因子，是G1期的关键调节因子，与肿瘤细胞恶性增殖密切相关[17]。Myc编码3种高度相关的核磷蛋白，即c-Myc、N-myc、L-Myc，其中c-Myc是具有原癌基因功能的碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链蛋白，参与细胞增殖、分化和凋亡。c-Myc是一种高效转录因子，可通过调节高达15%的基因表达，从而调控细胞周期进程、增殖、分化及凋亡等[18]。因此，在肿瘤细胞中抑制c-Myc蛋白表达及活性，有助于抑制恶性肿瘤细胞增殖，阻止疾病进展。BCL-2家族是调节肿瘤细胞程序性细胞死亡的重要蛋白，主要包括抗凋亡蛋白(BCL-2、BCL-XL和MCL-1等)以及促凋亡蛋白(BAX、Bak、Bid和Bad等)[19]。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间的不平衡是导致肿瘤细胞异常增殖的生物学特征。BCL-2主要位于内质网和线粒体中，通过影响Caspases活化或调节线粒体的膜通透性，干扰抑制线粒体凋亡因子释放到细胞质中，从而抑制细胞凋亡[20]。WP1066作用SKOV3细胞后可抑制BCL-2蛋白表达，从而表现出促进SKOV3细胞凋亡的作用。MMPs是一类依赖锌离子和钙离子的蛋白水解酶，可水解包括层黏连蛋白、胶原蛋白、纤黏连蛋白、蛋白聚糖等多种细胞外基质，在正常组织生长发育、组织重塑、炎症反应及创伤修复等生理病理过程中发挥关键作用。根据其作用底物不同，可分为胶原酶(MMP-1/8/13/18)、明胶酶(MMP-2和MMP-9)、基质溶素(MMP-3/7/10/11/28/27)、弹性蛋白酶(MMP-12)、与MMP-2活化有关的前肽区域中膜型特异性MMP(MMP-14/15/16/17/24/25)以及其他MMP(MMP-19/20/21/22/23/28)六类[21]。研究表明，MMP-2参与卵巢癌的发生、发展，其表达水平与卵巢癌的临床分期和转移呈正相关，而与病理分级及年龄无明显相关性[22]。此外，MMP-9与卵巢癌的分化程度、FIGO分期及淋巴结转移密切相关[23]。卵巢癌患者MMP-2和MMP-9高表达提示其预后更差。本研究结果显示，WP1066可抑制SKOV3细胞中Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达，抑制效果与顺铂相当，且两药联合抑制作用更强。

综上所述，STAT3抑制剂WP1066具有促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡、抑制细胞侵袭的作用，其机制与抑制Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2及MMP-9蛋白表达有关。

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