白血病抑制因子受体过表达对肺癌干细胞凋亡的影响及其机制

姜琪，任雪松，刘春华，张艳，汤秦

(1四川绵阳四○四医院，四川绵阳621000；2绵阳市中心医院)

肿瘤干细胞是一类具有自我更新、无限增殖、多向分化能力的细胞，是肿瘤无限生长的主要原因，也是恶性肿瘤复发、转移及治疗耐药的根本原因[1～3]。肺癌干细胞(LCSC)表面表达跨膜糖蛋白(CD133)、Ⅰ类跨膜糖蛋白(CD44)、醛脱氢酶(ALDH)、胰岛素样生长因子1(IGF1)和胰岛素样生长因子1受体(IGF1-R)等，流式细胞术可据此分选LCSC[4]。白血病抑制因子受体(LIFR)基因在多种恶性肿瘤组织中存在表达下调现象[5]，而LIFR过表达可抑制多种肿瘤进展，如乳腺癌和肝癌等[6，7]。目前鲜见LIFR过表达对LCSC凋亡影响的报道。2016年3月～2017年10月，本研究观察了LIFR过表达对LCSC凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3单抗和兔抗人GAPDH多抗(CST，美国)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(博士德生物工程有限公司，湖北武汉)，PE标记的CD133流式抗体CD133-PE(BD，美国)，LIFR慢病毒载体质粒及对照空载体质粒(GeneCopoeia构建，美国)，Lipofectamine2000转染试剂、TRIzol试剂(Invitrogen，美国)，RNA抽提试剂盒(Applied Biosystems，美国)，TaqMan逆转录试剂盒 (Life Technologies,英国)，qSYBR-Green-containing PCR试剂盒(Qiagen,美国)，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物技术股份有限公司，江苏)，蛋白提取试剂盒、ECL增强化学发光试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒(Thermo，美国)，ChemiDocTM触摸成像系统(Bio-Rad，USA，配合Image LabTMTouch软件Version1.0使用)，IX71奥林巴斯倒置显微镜(Olympus公司，日本，CCD图像传感器，配合Image-Pro Plus7.0成像系统使用)，紫外可见分光光度计(Thermo，Nanodrop2000，美国)，BD FACSAriaTM流式细胞分选仪(BD，美国)。

1.2 LCSC分选和培养 肺癌组织标本取材于四川绵阳四○四医院收治的1例肺癌患者原发灶，病理类型为腺癌。该患者于2016年12月在该院接受治疗，男性，42岁，无其他基础疾病，术前未进行任何抗肿瘤治疗，术中切除的肺癌标本经病理科确认后，无菌条件下迅速置于RNAlater保存液中，-80 ℃保存。所有过程遵从赫尔辛基宣言标准，研究方案经该院医学伦理委员会批准，在充分告知可能存在的风险后，该患者签署了知情同意书。无菌条件下取术中获得的人肺癌原发灶标本约2.5 cm3，置于装有Hanks液的无菌培养皿内，漂洗3 min×2次，用眼科弯剪将组织剪成大约1 mm3的小块，加入1%胶原消化液于室温下消化0.5 h，将细胞悬液过0.45 μm的细胞筛，室温下1 000 r/min离心5 min，弃上清，共离心2次。最后调整单细胞悬液密度为1×107个/mL。取2 mL单细胞悬液接种于25 mL的培养瓶内，培养基含DMEM-F12(1∶1)500 mL、B27(1∶50)10 mL、20 ng/mL表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)各500 μL。收集对数生长期细胞，室温下1 000 r/min 离心5 min，弃上清。PBS清洗2次，1 000 r/min离心5 min，用PBS调整细胞密度至5×105个/mL，将细胞平均分为两份，分别移至流式管中，一份加入CD133-FITC抗体，一份加入FITC及PE标记的对照抗体，各加入10 μL，加入FcR阻断剂20 μL，缓冲buffer 80 μL，充分混匀后，4 ℃条件下避光静置15 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗1次，弃上清，用流式细胞仪分选出CD133+肺癌细胞亚群，即为LCSC。LCSC培养于含无血清培养基的低吸附6孔板中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱内孵育，每5天加入新鲜培养基1.5 mL以补充干细胞生长所需的生长因子和营养，当干细胞球数量为200～300个时传代，取传3代细胞进行后续实验。

1.3 稳定过表达LIFR的LCSC构建 将含LIFR的重组慢病毒质粒及其阴性对照慢病毒空载体质粒control(均带EGFP荧光标签)分别以病毒/细胞数量为18的比例感染LCSC，3 天后观察荧光的表达量，并加入2.0 μg/mL嘌呤霉素继续培养。培养1周，所有细胞可观察到荧光表达，证实稳定过表达LIFR的LCSCLIFR及其阴性对照LCSCcontrol构建成功。

1.4 LIFR mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。分别取LCSCLIFR及LCSCcontrol，消化后离心，弃上清，收集沉淀。向沉淀中加入1 mL TRIzol，室温孵育15 min裂解细胞，4 ℃下12 000 r/min离心 15 min，取上清，每毫升TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，冰上孵育15 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，缓慢取上清，避免吸入中间层的白色物质，上层水相体积约为所用TRIzol试剂的60%，将吸取的上清置于另一干净EP管内，加入等体积的异丙醇沉淀水样中的RNA，颠倒混匀，4 ℃下12 000 r/min离心15 min,见RNA沉淀附着于EP管，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃下7 500 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥，加入30 μL无RNase水溶解，取1 μL测RNA浓度和纯度，剩余RNA立即放入-20 ℃保存备用。以上述提取的细胞总RNA为模板，按逆转录试剂盒说明书进行操作，逆转录生成cDNA。以cDNA为模板，按qSYBR-Green-containing PCR试剂盒的说明书进行操作。反应体系体积20 μL，设置3个复孔。LIFR引物由Invitrogen公司合成。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算LIFR mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。取培养至第3代的LCSCLIFR及LCSCcontrol，调整细胞密度为1×105个/mL，接种于6 cm培养皿中，每皿5 mL。培养48 h后PBS清洗3次，加入0.25%胰酶，吹打至悬浮状态，每皿加入100 μL缓冲液、5 μL Annexin Ⅴ-FITC及5 μL 0.5 mg/L PI，4 ℃避光静置15 min，于流式细胞仪上检测各组细胞凋亡情况。统计右下和右上象限的数值之和(早期凋亡与晚期凋亡细胞之和)，计算细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.6 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达检测 采用Western blotting法。按照蛋白提取试剂盒、ECL增强化学发光试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒说明书进行操作，分别提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度。取蛋白样本30 μg，进行10%SDS-PAGE，电泳结束将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上。5% BSA室温封闭1～2 h，分别加入1∶100 000的兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3和内参GAPDH抗体，4 ℃过夜。用TBST洗膜10 min×3次，二抗孵育，1∶1 000二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔)，室温孵育1 h，随后TBST洗膜10 min×3次。最后加入ECL发光剂并曝光，采用ChemiDocTM触摸成像系统扫描并保存蛋白条带的图片，Quantity One软件分析，以目的蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3电泳条带灰度值与内参GAPDH蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 LCSCLIFR及LCSCcontrolLIFR mRNA相对表达量比较 LCSCLIFR及LCSCcontrolLIFR mRNA相对表达量分别为8.54±1.32、1.03±0.02，两组比较P<0.05。

2.2 LCSCLIFR及LCSCcontrol细胞凋亡率比较 LCSCLIFR及LCSCcontrol细胞凋亡率分别为(35.00±5.29)%、(11.33±1.76)%，两组比较P<0.05。

2.3 LCSCLIFR及LCSCcontrolBcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相对表达量比较 与LCSCcontrol相比，LCSCLIFRBcl-2蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3蛋白相对表达量明显升高(P均<0.05)。见表1。

3 讨论

大量研究显示，肿瘤细胞中存在一小部分可维持肿瘤细胞异常生长的亚群，这群细胞具有无限增殖和多向分化能力，被认为是导致肿瘤复发和转移的根本原因，即为肿瘤干细胞[8]。

表1 LCSCLIFR及LCSCcontrol Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相对表达量比较

注：与LCSCcontrol比较，*P<0.05。

LIFR是极其重要的肿瘤转移抑制因子，其在多种肿瘤中存在表达失调现象，如在肺癌和乳腺癌中均存在表达缺失现象，且其表达缺失与乳腺癌的淋巴结阳性状态、肿瘤分级增加、远处转移风险增加及总体生存率降低密切相关[9，10]。本研究选择CD133为分选标志物基于以下考虑：①CD133跨膜糖蛋白是顶端质膜上重要的细胞膜蛋白，是多种肿瘤干细胞分选及鉴别的分子标志物，如白血病和胶质瘤均选择CD133为分选标志物[11，12]；②采用流式分选技术以CD133为LCSC分选标志物，分选出的LCSC具有增殖能力显著增强、有多向分化特性、对多种化学抗癌或靶向抗癌药物的治疗产生显著的耐药性的特点[13]。本研究通过慢病毒质粒转染的方法筛选并成功构建了LCSCLIFR及LCSCcontrol细胞株，证实LCSCLIFR细胞株LIFR mRNA相对表达量明显高于LCSCcontrol，表明LCSCLIFR细胞确实存在LIFR过表达。LCSCLIFR细胞凋亡率明显高于LCSCcontrol细胞，表明过表达LIFR可促进LCSC细胞凋亡。LCSC细胞受到抑制的细胞凋亡机制被重新激活，这有助于降低LCSC的恶性程度，进而降低其增殖、侵袭和转移能力。

Bcl-2、Bax和Caspase-3是最重要的3个凋亡相关蛋白，其中Bax和Caspase-3是重要的促凋亡因子，Bcl-2是重要的凋亡抑制因子，Bcl-x、Bcl-2和Caspase-3的表达和活性水平可反映肿瘤细胞的凋亡状态，也是导致肿瘤细胞凋亡水平变化的原因[14，15]。已有研究证实，Bax和Bcl-2是调控细胞凋亡活动的重要胞内蛋白质，两者在肿瘤的发生及恶性进展中发挥重要作用[16]。Caspase-3则是介导细胞凋亡的核心蛋白酶，是细胞凋亡蛋白酶级联反应最重要的执行者，是在各种原因及因素引起的凋亡活动中起最终枢纽作用的蛋白[17]。Bcl-2家族蛋白是一种具有双重调控功效的蛋白，既可促进细胞凋亡(如Bax)，又可促进细胞增殖并阻止细胞凋亡(如Bcl-2)[18]。研究显示，Bcl-2为癌基因，可通过阻碍细胞色素C释放到细胞质、抑制Caspase蛋白水解而发挥抑制细胞凋亡作用[19]。Bax为Bcl-2的抑制因子，两者之间或单独可形成异源或同源二聚体，共同调节细胞凋亡活动，两个Bax的同源二聚体可促进细胞凋亡，而Bcl-2和Bax的异源二聚体则抑制细胞的凋亡能力[20]。若Bcl-2/Bax 比例降低则促进细胞凋亡[21]。本研究结果显示，LCSCLIFRBax和Caspase-3蛋白相对表达量明显高于LCSCcontrol，而Bcl-2蛋白相对表达量明显低于LCSCcontrol，即Bcl-2/bax比例显著降低；LCSCLIFR细胞凋亡核心调控蛋白Caspase蛋白表达明显高于LCSCcontrol，细胞凋亡率亦高于LCSCcontrol，说明LIFR过表达对LCSC的抑制作用可能是通过增加Bax和Caspase-3蛋白表达、抑制Bcl-2蛋白表达而实现的，而LIFR调控上述凋亡相关蛋白的具体途径还需进一步进行研究。

综上所述，LIFR过表达可促进LCSC细胞凋亡，其机制可能与抑制Bcl-2蛋白表达、促进Bax和Caspase-3蛋白表达有关。临床可针对上述靶点研发相应药物。

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