百里醌通过磷酸化p38MAPK途径介导NSCLC细胞毒性作用的机制研究

陈子盛,廖小雯,张亦飞,肖靖华,陈 芸,刘清霞,王 鹏,车鹏彪,朱连雨,田东波

(1.广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院 呼吸二病区,广东 清远,511500; 2.广东省五邑中医院 神经内科,广东 江门,529000)

肺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤之一，研究[1]表明2012年全球新发肺癌患者1.82/百万，死亡1.59/百万，肺癌约占所有肿瘤相关性死亡的18%。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%～85%,Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC单纯根治术后5年存活率约70%,而晚期NSCLC 5年存活率<5%[2]。目前中国晚期NSCLC除针对驱动基因精准靶向治疗，最常用一线化疗是含铂两药方案，即长春瑞滨、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、替吉奥联合铂类，复发转移、治疗失败的NSCLC,通常是对以铂类为基础的化疗方案不应答或耐药[3],因而急需寻找新治疗方法，以降低一线方案耐药或提供有效稳定新靶点。

百里醌(TQ))是黑种草籽(Nigella damascena)挥发油的主要生物活性成分，有研究[4-5]表明TQ具有抗炎、抗氧化、抗高血压、抗菌、抗哮喘、抗肿瘤等功效,TQ能抑制乳腺癌、白血病、黑色素瘤、结肠癌、宫颈癌、多耐药卵巢癌、前列腺癌细胞增殖，且减少顺铂化疗方案不良反应如心肌损伤[6],并对正常细胞具有较高剂量耐受性[7],提示TQ具有较好安全性，有望成为NSCLC治疗选择。本研究探讨TQ对NSCLC毒性作用的分子机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞培养

SK-MES-1、95-D肺鳞癌细胞和A549肺腺癌细胞，均购自中国科学院细胞库(上海)，TQ(纯度≥98%)、U0126和SB203580均购自Sigma,实验所需抗体p-p38、p38，p-ERK1/2、ERK1/2，p-JNK、JNK,β-actin均购自Cell Signaling Technology，化学发光试剂盒购自Millipore。SK-MES-1、95-D、A549培养条件均为: DMEM培养基(高糖，含10%胎牛血清，不加双抗),5%CO2,37.0 ℃。

1.2 实验设计及分组

采用DMSO溶解TQ后配成100 mmol/L,按梯度稀释法配成工作液浓度，对照组加入同体积的DMSO。

1.3 MTT测细胞毒性

SK-MES-1、95-D、A549细胞接种于96孔板,5 000个/孔，细胞贴壁后同步化12 h,分别加20、40、60、80、100 μmol/L的TQ，每个浓度设6复孔，孵育24 h后吸掉培养基，每孔加PBS稀释的1×MTT液100 μL培养4 h,弃上清，每孔加100 μL DMSO，震荡使结晶充分溶解，酶标仪570 nm测吸光度OD值，细胞存活率%=OD实验组/OD对照组×100%,利用excel回归方程计算TQ的IC50值。SK-MES-1时间依赖性实验细胞接种密度同上，予约TQ IC50浓度分别作用10 min、24 h、48 h,MTT检测方法如上计算细胞存活率。

1.4 Western blot实验

将指数生长期的SK-MES-1细胞接种于10 cm2培养皿，密度为1.5×106个/皿，贴壁后同步化12～16 h，处理组予10 μmol/L的U0126预处理1 h后加入TQ孵育30 min，对照组予DMSO处理，提取总蛋白，采用BCA法测样品总蛋白浓度，按Western blot实验方法进行电泳、转膜、5%脱脂牛奶封膜，一抗为羊抗兔p-p38、p38,p-ERK1/2、ERK1/2，p-JNK、JNK，4℃孵育过夜或者室温1 h，TBST清洗后室温下兔二抗孵育30 min，最后利用化学发光试剂盒显影并采集图像。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 不同浓度TQ对NSCLC细胞毒性作用

分别予20、40、60、80、100 μmol/L TQ孵育SK-MES-1细胞24 h,可见TQ呈浓度依赖性发挥细胞毒性作用，通过Excel回归方程式计算,TQ IC50≈66 μmol/L,予60 μmol/L TQ分别作用10 min、24 h、48 h,可见TQ呈时间依赖性发挥细胞毒性作用(图1A、B),扩展至95-D和A549细胞，同样观察到TQ呈浓度依赖性降低细胞存活率(图1C、D)。

A.TQ呈浓度依赖性发挥SK-MES-1细胞毒性作用,***P=0.000;

B.TQ呈时间依赖性发挥SK-MES-1细胞毒性作用,***P=0.000;

C.TQ呈浓度依赖性发挥95-D细胞毒性作用,***P=0.000;

D.TQ呈浓度依赖性发挥A549细胞毒性作用,*P<0.05,**P<0.01。

图1不同浓度TQ对NSCLC的细胞毒性作用

2.2 TQ通过p38途径介导NSCLC细胞毒性作用

为验证TQ是否通过p38途径介导NSCLC细胞毒性作用，对照组予30和60 μmol/L TQ作用于SK-MES-1 1h; 实验组分别予10 μmol/L U0126和10 μmol/L SB203580预处理1 h后，分别加入30和60 μmol/L TQ 1 h,吸掉含药培养基，加正常培养基，培养24 h后行MTT检测。结果表明,30 μmol/L TQ和10 μmol/L U0126+30 μmol/L TQ比较其细胞存活率有显著差异(P=0.000)，但与10 μmol/L SB203580+30 μmol/L TQ比较无差异(P=1.00)，10 μmol/L SB203580+30 μmol/L TQ与10 μmol/L U0126+30 μmol/L TQ组比较有显著差异(P=0.000); 随着TQ浓度增加，60 μmol/L TQ、10 μmol/L U0126+60 μmol/L TQ、10 μmol/L SB203580+60 μmol/L TQ组两两比较，其细胞存活率均无显著差异(P>0.05)，表明即使低剂量TQ状态下,ERK抑制剂U0126也不能阻断TQ的细胞毒性作用，即TQ不是通过活化ERK1/2起效，但p38抑制剂SB203580则明显降低TQ的细胞毒性作用，表明TQ可快速(1 h)通过p38途径介导细胞毒性作用，可是随TQ浓度升高接近IC50值,SB203580短暂抑制不能明显保护SK-MES-1(图2)。

予10 μmol/L SB203580预处理95-D细胞1 h后，分别加入按梯度稀释的5～40 μmol/L TQ孵育1 h,换正常培养基培养24 h。10 μmol/L SB203580+40 μmol/L TQ组为10 μmol/L SB203580预处理1 h,加40 μmol/L TQ(≈95-D的TQ IC50值)孵育1 h后，更换含10 μmol/L SB203580的正常培养基培养24 h。MTT结果表明，随TQ浓度增加,SB203580对95-D细胞保护作用逐渐减弱,10 μmol/L SB203580+40 μmol/L TQ组与40 μmol/L TQ组比较其细胞存活率仍有显著差异(P=0.033),表明持续p38抑制仍能明显降低TQ对95-D细胞毒性作用(图3)。

∗P=0.016, ∗∗∗P=0.000。图2 TQ透过p38介导SK-MES-1细胞毒性作用

∗P=0.033。图3 TQ通过p38途径介导95-D细胞毒性作用

2.3 TQ对NSCLC细胞毒性作用的分子机制

Western blot结果表明U0126能显著抑制ERK1/2磷酸化,p38随TQ浓度增加而磷酸化增加，但ERK1/2磷酸化减少,JNK磷酸化无明显变化，表明TQ通过磷酸化p38介导细胞毒性作用，而不是ERK1/2(图4)。

图4 TQ对NSCLC细胞毒性作用的分子机制

3 讨 论

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，刺激信号如生长因子、细胞因子、射线、基因毒性化疗药、应激、渗透压等均可激活MAP3K,产生级联效应，活化MAPK(ERK、JNK/SAPK、p38),MAPK一旦被胞外刺激信号激活将广泛调节细胞增殖、迁移、凋亡、分化和衰老[8]。许多化疗药需激活p38才能发挥作用，通过重新激活p38诱导癌细胞凋亡被认为是治疗NSCLC的重要途径之一[9],p38活化增强化疗敏感性，促进癌细胞凋亡，引起癌细胞周期停滞，抑制癌细胞生长和分化[10],比如在乳腺癌细胞中环磷酰胺、结肠癌细胞中奥沙利铂均通过活化p38通路而诱导癌细胞凋亡[11-12],依托泊苷增加NSCLC细胞MKK3/6-p38的磷酸化[13],活化的p38通过灭活Met受体增强顺铂化疗敏感性[14]。

TQ具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等功效，本研究表明TQ呈浓度及时间依赖性发挥NSCLC细胞毒性作用。为进一步验证TQ是否通过p38途径介导NSCLC细胞毒性效应，予10 μmol/L U0126和10 μmol/L SB203580预处理SK-MES-1,抑制ERK1/2和p38磷酸化，加入30 μmol/L TQ后孵育1 h后更换正常培养基培养24 h,结果表明U0126并不能防止TQ对SK-MES-1的毒性作用，但SB203580却对SK-MES-1有保护作用，其细胞存活率与正常组比较无显著差异，表明TQ可能通过磷酸化p38介导细胞毒性作用，但当TQ浓度接近IC50值时(60 μmol/L),10 μmol/L SB203580+60 μmol/L TQ组与10 μmol/L U0126+60 μmol/L TQ、60 μmol/L TQ组细胞存活率比较均无显著差异，表明当TQ达到一定浓度时,SB203580短时间抑制p38不再能阻断TQ毒性作用。对95-D予接近IC50值的TQ浓度40 μmol/L作用1 h后，更换含10 μmol/L SB203580的培养基培养24 h,与40 μmol/L TQ组比较，细胞存活率显著增加，表明持续p38抑制明显降低TQ对NSCLC细胞毒性作用。

进一步探讨TQ对NSCLC细胞毒性作用的分子机制，结果表明p38随TQ浓度增加而磷酸化增加，但ERK1/2磷酸化减少，而JNK磷酸化无明显改变，表明TQ透过磷酸化p38介导细胞毒性作用，同时抑制ERK1/2介导的细胞增殖信号，并非

如Yang J等[15]表明TQ通过磷酸化ERK1/2抑制NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭。

综上所述,NSCLC细胞基本不表达p-p38,一旦其p38磷酸化，即可诱发NSCLC细胞毒性级联反应,TQ在短时间内(1 h)就能决定24 h后NSCLC细胞的存亡，同时抑制ERK1/2介导的细胞增殖信号。由此可见,TQ是一种极有前景、值得继续深入探讨的备选抗癌药或者辅助化疗增敏药。

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