小麦HMW-GS分子检测中DNA提取方法的改良

2018-06-19张婷婷王陆军郝建平王艳梅王创云李培良邓艳芳李志敏董永军裴成成牛学谦

山西农业科学 2018年6期

张婷婷，王陆军，郝建平，，王艳梅，王创云，李培良，邓艳芳，周琼，李志敏，庞冰，董永军，裴成成，牛学谦

（1.山西大学生命科学学院，山西太原 030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原 030031；3.山西省玉米工程技术研究中心，山西太原 030031）

随着人们对高品质小麦需求的增长，品质育种受到了更多科学家的关注。有研究表明，高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）组成是影响小麦品质的重要因素[1-2]。当前检测HMW-GS的方法主要包括SDS-PAGE凝胶电泳和等位基因特异性扩增（AS-PCR）[3-4]，其中，AS-PCR 方法操作简便，结果准确，可以实时检测，是实现小麦HMW-GS分子育种的有效检测方法。而高质量、高通量的DNA提取是实现HMW-GS实时检测的前提。前人提取基因组DNA的方法主要包括传统CTAB法[5-8]、SDS法[9-10]、碱裂解法[11-12]、酶解法、磁珠法[13]、硅胶柱法[14]等，这些方法多以幼叶为提取材料，存在成本高、周期长、操作复杂或质量不稳定等问题。

本研究在传统CTAB法的基础上，针对小麦种子蛋白、淀粉含量高的特点，结合磁珠法，旨在寻求一种操作简便、成本低廉、产率和质量稳定的DNA提取方法，以满足日益增加的HMW-GS高通量分子检测的需求。

1 材料和方法

1.1 材料

供试10份小麦材料（Triticum aestivum L.）均由山西省农业科学院作物科学研究所提供，其品种名称与亚基组成如表1所示。

1.2 试剂

2%CTAB裂解液，氯仿∶异戊醇（24∶1），70%乙醇，异丙醇，TE（含RNaseA），磁珠悬浮液。

表1 10份小麦材料及其亚基组成

1.3 仪器

HH数显恒温水浴锅（常州市第一纺织设备有限公司）；Tissuelyser-96全自动样品快速研磨仪（上海拓赫机电科技有限公司）；5810R低温高速离心机（德国Eppendorf艾本德股份公司）；PCR仪（德国Eppendorf艾本德股份公司）；K5600超微量紫外可见分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司）；JY-SPCT君意东方水平型琼脂糖凝胶电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；Tanon 2500凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 传统CTAB法参照魏琦超等[15]的方法。

1.4.2 小麦DNA提取新方法取1粒小麦种子，加入700 μL CTAB提取液（65℃）；粉碎成匀浆状；将样品放入65℃水浴锅中，水浴30 min；加入等体积氯仿/异戊醇混合液（体积比24∶1），充分混匀3 min；4 ℃，14 000 r/min 离心 10 min，取上清；重复抽提一次；加入5 μL的磁珠悬浮提取液，混匀，静置5 min，弃上清；用70%乙醇洗涤磁珠1～2次，风干磁珠；加 50 μLTE（含 RNaseA），65 ℃水浴 5 min，-20℃保存。

1.4.3 DNA质量检测

1.4.3.1 紫外分光光度法检测采用紫外分光光度计测定DNA原液的浓度及其A260/230，A260/280的值。

1.4.3.2 琼脂糖凝胶电泳取4 μL的DNA原液与2 μL的6×Loadingbuffer混合均匀，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，电压100 V，电泳60 min。

1.4.4 HMW-GS分子检测引物1AX2*[16]序列F：5′-ATGACTAAGCGGTTGGTTCTT-3′；R：5′-ACCTT GCTCCCCTTGTCTTT-3′。以新方法提取的DNA为模板，对亚基2*进行AS-PCR，扩增程序参照孙岩等[17]的方法，并进行了改进，采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

2 结果与分析

2.1 DNA产率比较

紫外分光光度计检测结果显示，新方法提取的DNA比对照（传统CTAB法）平均产率降低，标准差减小（表2）。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，对照的电泳条带亮度比较高，差异较大（图1），新方法提取的DNA电泳条带相对亮度较低，但差异较小（图2）。2种检测结果均证实了新方法提取的DNA产率降低，但稳定性更好。

表2 分光光度计检测结果

2.2 DNA质量比较

从表2可以看出，对照和新方法提取的DNA的A260/280平均值均在1.8～2.0，但新方法标准差较小。从图1，2可以看出，对照的DNA胶孔较亮，有拖尾现象，且条带不整齐，而新方法提取的DNA电泳条带清晰一致，背景噪点较少。因此，采用新方法提取的DNA质量更高更稳定。

2.3 HMW-GS分子检测

选择10份小麦种质资源，采用新方法提取的基因组DNA为模板，对亚基2*进行等位基因特异性扩增（AS-PCR）。电泳检测结果（图3）显示，条带清晰，片段大小为1 319 bp，这与SDS-PAGE检测结果一致。因此，新方法提取的DNA可以用于小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）的分子检测。

3 讨论与结论

本研究对DNA提取过程进行了改进：样品在CTAB裂解液的保护下直接机械粉碎破坏细胞壁，省去了液氮研磨；在沉淀DNA时，放弃加入异丙醇沉淀20 min，而采用磁珠定向吸附DNA，直接以70%的酒精洗涤。通过上述改进，提高了DNA的质量和稳定性，简化了操作，缩短了提取周期，使高通量提取成为可能。

本研究在测量DNA的A260/280值时发现2种方法的平均值均在理想范围内，虽然存在差异但不显著，在琼脂糖凝胶电泳检测中二者结果差异显著，尤其传统CTAB法提取的DNA一致性差，而新方法提取的DNA纯度高、稳定性好。说明紫外分光光度计所测得数值相对误差较大，这一结果与前人研究结果一致[18]。因此，在检测DNA质量时，建议先采用紫外分光光度计进行检测，然后以琼脂糖凝胶电泳验证结果。

HMW-GS分子检测相对SSR[19]等分子标记，对DNA质量要求更高，本研究检测了HMW-GS中的2*亚基，结果清晰准确，证明新方法可以用于小麦HMW-GS 分子检测[20]。

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