甘蓝型油菜BnMYB1基因克隆及其对非生物胁迫的响应

樊 溢，刘 明，王景雪

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

MYB蛋白是植物最大的转录因子家族之一[1]。目前MYB转录因子已经从许多植物中克隆和鉴定出来，其中在拟南芥中已经发现有超过196个MYB基因，玉米有超过157个MYB基因[2-3]。MYB蛋白含有1～3个串联的、不完全重复的MYB结构域（R1，R2和R3）。每个结构域由51～52个氨基酸序列组成。根据MYB结构域数目的不同，将MYB转录因子分为3类，分别为：R1-MYB，R2R3-MYB和R1R2R3-MYB[4]。其中，R2R3-MYB类转录因子是目前研究最为广泛的一类MYB转录因子，其含有R2和R3等2个保守结构域，每个结构域含有3个保守的色氨酸残基起着疏水核心的作用，主要参与调控植物发育、代谢和对生物与非生物胁迫的反应等多种生理过程[5-7]。以往的研究表明，MYB蛋白在植物对逆境胁迫的响应上有着重要作用[8]。

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是我国乃至全世界重要的油料作物。菜籽油不仅是优质的食用油，也是重要的工业原料和生物能源，大力发展油菜产业有助于保障我国的粮油安全，促进农民增收，还能为我国能源安全战略作出重要贡献。然而，由于全世界范围内土地干旱和土壤盐渍化的趋势愈加严重，油菜生产也面临着日益严重的干旱威胁。干旱、土壤盐渍化会引起油菜形态、生理生化及分子水平等一系列的变化，导致产量下降[9-10]；贺亚军等[11]通过对甘蓝型油菜耐盐相关性状进行全基因组关联分析，发现MYB转录因子与油菜的耐盐性相关。

本研究以甘蓝型油菜晋油4号为试验材料，并从其叶片组织中克隆到了编码BnMYB1转录因子的基因，检测其在不同组织部位的表达量，并测定其在应对不同非生物胁迫下的表达情况，为进一步研究BnMYB1基因的功能和利用BnMYB1基因选育油菜新品种奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验以甘蓝型油菜晋油4号为试验材料。晋油4号种子由山西省农业科学院棉花研究所油菜育种研究室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 油菜基因组DNA提取及PCR扩增Bn－MYB1基因 本研究利用NCBI已发表的BoMYB1基因（GenBank登录号：GU219985.1），根据其序列使用Primer 5.0软件设计ORF保守区上下游引物BoMYB1-F：5′-CGGGATCCATGGAGGATTCGT-3′和 BoMYB1-R：5′-AACTGCAGCTAATCAAGTTCTA CAG-3′，利用CTAB法提取晋油4号叶片组织基因组，运用聚合酶链式反应（PCR）进行体外扩增。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，72℃终延伸 10 min，共30个循环；4℃下保存。

1.2.2 BnMYB1基因扩增产物的克隆与测序PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，将产物条带从胶上切下，按照SanPre柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程公司）的步骤进行回收。将回收的PCR产物克隆到pMD19-T（TakaRa）载体上。将10 μL重组质粒加到100 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中轻摇匀，冰上放置30 min后42℃水浴热激90 s，加入1 mL不含抗生素的LB液体培养基于37℃，180 r/min复苏2 h，然后将菌液涂布到含有氨苄青霉素的固体LB培养基上37℃过夜倒置培养，次日挑选单菌落进行阳性克隆鉴定。按照SanPre柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工生物工程公司）步骤进行质粒抽提，进行PCR鉴定，确定为阳性后，将抽提的质粒使用M13通用引物送至上海生工生物工程公司进行测序。克隆得到的基因命名为 BnMYB1（KP296768）。

1.2.3 BnMYB1转录因子基因序列生物信息学分析 将测序结果进行一系列生物信息学分析，使用NCBI上的ORF finder程序推导目的基因的氨基酸序列；通过 ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析相对分子量、等电点及疏水性等理化性质；采用SignalP4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽预测和蛋白亚细胞定位；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpr ed_sopma.pl）进行二级结构预测；利用ProtFun（https://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）进行蛋白功能预测；利用 Motif Scan（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan#GRAPHIC）进行蛋白功能结构域的分析；利用clustal 1.81软件进行多序列比对，结合MEGA7软件构建系统发育树。

1.2.4 BnMYB1转录因子在油菜幼苗不同组织部位中的表达分析 在人工气候室内种植油菜，生长28 d后，分别取幼苗的根、茎、叶组织，使用Trizol（TaKaRa）提取总 RNA，使用 PrimeScript RT gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa）将提取的总RNA反转录成cDNA，使用 SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）试剂进行qRT-PCR试验，将油菜Actin基因的相对扩增作为内部对照。利用Primer 5.0软件分别设计Bn－MYB1和Actin基因的上下游引物。BnMYB1：F5′-AGGATTCGTCCAAAGGGTT-3′；R5′-AGCTGGGCT TAATAGGTGTAGG-3′。Actin：F5′-CCCTGGAATT GCTGACCGTA-3′；R5′-TGGAAAGTGCTGAGGGAT GC-3′。qRT-PCR 反应条件为：95℃，15min；94℃，10 s，57 ℃，15 s，72 ℃，20 s，共 40 个循环。

1.2.5 油菜幼苗非生物胁迫种类及处理方法 在油菜幼苗期，本研究选取了盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫和水杨酸处理等4种非生物胁迫，分别对油菜幼苗进行不同处理，不同处理时间下采叶片提取总RNA，反转录成cDNA。用1.2.4的所列引物，进行qRT-PCR扩增，检测BnMYB1基因在各种胁迫下的表达量。

1.2.5.1 盐胁迫试验 油菜种子在室内23℃条件下发芽，待油菜生长28 d后进行盐胁迫。具体方法：对油菜幼苗停止正常浇水，使用200 mmol/L NaCl溶液，对幼苗进行高盐处理，用等量蒸馏水处理作为对照。在 0.5，1，4，8，16，24，48，72 h 后分别取叶片进行后续试验。

1.2.5.2 干旱胁迫试验 油菜种子在室内23℃条件下发芽，待油菜生长28 d后进行干旱胁迫。具体方法：对幼苗停止正常浇水，代之浇含有200 g/L PEG-6000的水溶液，进行模拟干旱试验，用等量蒸馏水处理作为对照。在 0.5，1，4，8，16，24，48，72 h后分别取叶片进行后续试验。

1.2.5.3 冷胁迫试验 油菜种子在室内23℃条件下发芽，待油菜生长28 d后进行冷胁迫处理。具体方法为：将幼苗置于4℃恒温培养箱中进行冷胁迫处理，在 0.5，1，4，8，16，24，48，72 h 后分别取叶片进行后续试验。

1.2.5.4 水杨酸处理 油菜种子在室内23℃条件下发芽，待油菜生长28 d后进行水杨酸处理。具体方法：对油菜幼苗停止正常浇水，叶面喷施5 mmol/L水杨酸，以喷施等量蒸馏水作为对照，喷施后0.5，1，4，8，16，24，48，72 h 分别采取叶片进行后续试验。

2 结果与分析

2.1 甘蓝型油菜BnMYB1基因克隆与分析

用设计的基因全长引物进行PCR扩增，PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出大小约1 300 bp的目的条带（图1），与预测结果大小一致。把回收的目的条带构建入pMD19-T载体，经过转化、鉴定后，提取质粒送上海生工生物工程公司进行测序。

2.2 甘蓝型油菜BnMYB1基因序列分析

序列测定结果分析表明，BnMYB1基因全长为1 393 bp，经NCBI中ORF finder推导出目的基因的氨基酸编码序列为1个753 bp的开放阅读框，编码250个氨基酸。经过比对分析，BnMYB1属于典型的R2R3-MYB亚家族，其N端含有R2，R3等2个保守的MYB结构域，R2和R3分别由51，50个氨基酸组成，R2结构域含有3个色氨酸（W），色氨酸之间有18～19个氨基酸间隔（图2），R3含有2个色氨酸，第1个色氨酸被亮氨酸（L）所取代。ProtParam预测结果表明，BnMYB1蛋白分子量为21.4 ku，等电点为9.13，平均亲水性系数（GRAVY）为-0.426，亲水氨基酸数占总氨基酸数的83.2%，故可推测BnMYB1蛋白为小分子亲水性蛋白；根据SignalP4.1 Server信号肽预测结果表明，BnMYB1所编码的蛋白不存在信号肽，亚细胞定位预测显示该蛋白定位于细胞核中；BnMYB1蛋白二级结构预测显示，其蛋白质结构由62个α-螺旋（24.8%），31个延伸链（12.4%），150个无规则卷曲（60.16%）组成。生物学功能预测显示，BnMYB1蛋白具有合成辅酶因子、嘌呤、嘧啶和能量代谢、脂肪酸代谢等方面的功能（表1）。Motif Scan软件分析序列含有一个核定位序列（NLS），其作用与入核载体相互作用使BnMYB1蛋白被运进细胞核内发挥作用。

表1 BnMYB1编码蛋白功能预测

2.3 BnMYB1转录因子进化树构建

将来自不同物种的、与非生物逆境胁迫响应相关的MYB转录因子序列（包括：AtMYB30（822525），AtMYB96 （836367），AtMYB60（837403），OsMYB4（LOC4336407），TaMYB33（LOC100859950），GmMY-B92（DQ822903.1），ZmMYBZ2（DQ902861），PeMYB2（HM747940.1），ShMYB18 （ACT98139.1），CmMYB2（JF795918））与克隆得到的BnMYB1基因利用clustal 1.81软件进行多序列比对后，结合MEGA7软件构建系统发育树。结果表明，BnMYB1和其他作物逆境相关的R2R3-MYB蛋白表现出不同程度的相似性（图 3）。在拟南芥中，AtMYB60[12]和 At－MYB96[13]参与干旱胁迫，能调控气孔运动并影响根的生长；小麦中TaMYB33的过表达可以促进渗透压调节物质脯氨酸的合成，从而提高小麦的耐盐和耐旱性[14]。TaMYB32同样受盐胁迫诱导表达，在拟南芥中超表达TaMYB32，TaMYB33基因，均可使植株的耐盐能力有所增强[15]。BnMYB1与大豆Gm－MYB92处于同一分支，且转GmMYB92基因的拟南芥中，植株表现出更好的耐盐耐冻性[16]。因此，推测BnMYB1同样具有参与响应高盐、干旱胁迫的功能。

2.4 BnMYB1转录因子在油菜幼苗不同组织中的表达特征分析

晋油4号幼苗期分别取其根、茎、叶组织，提取其总RNA进行反转录，利用设计的qRT-PCR引物，对BnMYB1在甘蓝型油菜幼苗根、茎、叶中的相对表达量进行分析。从图4可以看出，BnMYB1在油菜根、茎、叶中均有表达，其中在叶片中表达最高，是根中表达量的15倍以上，而在根中的表达量最低。因此，推测BnMYB1对水分胁迫的响应主要是减少叶片对水分的蒸腾。

2.5 甘蓝型油菜BnMYB1对非生物胁迫的响应分析

取生长28 d的甘蓝型油菜幼苗，分别进行胁 迫处理，对照组用等量蒸馏水进行处理，分别提取不同处理的叶片总RNA，用qRT-PCR法分析其相对表达量。结果表明，在4种胁迫处理下，BnMYB1基因的表达量由于受外界瞬时刺激，在0.5 h时均处于较低状态。在高盐胁迫处理16 h内其表达量呈上升趋势，在处理16 h时BnMYB1基因表达明显上调，表达量最大，是对照的2.4倍，24 h后基因的表达低于对照，说明高盐胁迫诱导了BnMYB1转录因子基因的大量表达（图5-A）。

在PEG-6000模拟干旱胁迫下，BnMYB1基因在4 h内表达量迅速升高，4 h的表达量最高，为对照的3.7倍，之后随处理时间的增加，相对表达量逐渐减小，处理16～24 h其表达量接近对照且无显著差异（图5-B）。说明BnMYB1基因受干旱胁迫诱导，参与了油菜对水分胁迫的应答。

在4℃冷胁迫处理1～8 h内，BnMYB1基因表达量有升高趋势，在处理16 h时表达量水平最高，为对照的2.5倍；24 h后BnMYB1基因表达量均低于对照（图5-C）。水杨酸处理后，BnMYB1基因的表达量在1 h时略有升高，为对照的1.2倍，之后随处理时间增加，BnMYB1基因的表达量逐渐降低（图5-D）。

3 结论与讨论

已有研究表明，MYB作为植物体内最大的一类转录因子，参与植物次生代谢、器官的形成，调节激素和环境因子的应答、细胞分化、细胞周期[17]，尤其是R2R3类MYB转录因子在植物响应非生物胁迫方面发挥了关键的作用。油菜中关于MYB研究主要集中于花药发育和花粉形成等方面[18]，而关于MYB基因在油菜抗逆方面的研究较少。本研究从甘蓝型油菜晋油4号中克隆得到BnMYB1基因，该基因编码的蛋白质属于典型的R2R3-MYB类转录因子。已有研究证明，R2R3结构域在植物抵御非生物逆境胁迫方面有重要作用。

利用qRT-PCR技术分析发现，BnMYB1在油菜根、茎、叶中均有表达，在叶中表达量较高。在高盐、干旱、冷胁迫处理下，BnMYB1在叶中的表达量均有增高，表明油菜在应对非生物胁迫过程中BnMYB1发挥重要的作用。水杨酸作为植物内普遍存在的内源信号分子，主要参与植物对病原的防御反应。有研究表明，烟草的Myb1基因在受到外界水杨酸刺激后表达量增高，抗病蛋白随之增高，表明烟草Myb1在植物的抗病反应中起重要的调控作用[19]。本研究在对油菜外施水杨酸后，BnMYB1表达量升高，推测其可能也参与抗病蛋白基因的激活和植物抗病防卫反应。

植物对环境胁迫如干旱的抗性是受多基因调控的数量性状。因此，单一基因的改变往往对这些性状影响有限，而MYB转录因子可以通过调控其下游的一系列基因而共同作用，从而调节植物对环境胁迫的响应[20]。基于前人研究发现，植物在逆境影响下，R2R3-MYB类转录因子的表达量会发生明显变化，这一变化预示着这类转录因子将调控下游抗逆性基因的表达[21]，SHAN等[22]从菊花中克隆得到R2R3-MYB类转录因子CmMYB2基因，可以调控逆境相关基因的表达，在植株应对干旱和高盐胁迫过程中起到关键作用；肖冬长等[23]从毛竹中克隆得到R2R3-MYB类转录因子PeMYB2基因，其在拟南芥中的过表达可使植株对盐胁迫有更高的耐性。本研究获得的BnMYB1基因参与了逆境胁迫的响应，其作为转录因子如何调控下游基因表达需要进一步研究。

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