益气补肾法对裸鼠乳腺癌肺转移抑制作用及机制研究*

姚勇伟 朱飞叶 刘云霞 王翌庆 徐叶峰 浙江省杭州市第三人民医院 浙江 杭州 30009 浙江中医药大学基础医学院 浙江 杭州 30053

乳腺癌占女性恶性肿瘤发病率的第一位[1]，而肺部是乳腺癌较为常见的转移部位[2]。临床中乳腺癌术后发生的肺转移，患者存活率往往较低。我们前期研究表明，益气补肾法在预防和治疗乳腺癌术后的复发及转移方面，有不错的治疗效果[3]，有必要对其作用机制作进一步的研究和探讨。本实验采用左心室注射法制造乳腺癌术后肺转移裸鼠模型，观察益气补肾法对转移瘤的抑制作用，并探讨其可能作用机制。现总结如下。

1 材料

1.1 实验动物：BALB/c裸鼠（SPF级），均为雌性，体重18～20g，共40只，由浙江中医药大学实验动物中心提供饲养并实施实验。

1.2 细胞株：人乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231，从中国科学院上海细胞生物研究所购买。

1.3 试剂与药品：DMEM培养液（Gibco公司），胎小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司），基质金属蛋白酶（MMP-1、MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）ELISA试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）。大补元煎（《明·景岳全书》）：杭州市第三人民医院中药房提供（炒党参、熟地、杜仲、当归、山茱萸、枸杞、炙甘草，剂量比例为3:3:3:2:3:1:3:2）。按比例取药物适量，加5倍量水浸泡1h，煎煮60min，再加3倍量水，煎煮30min，合并两次煎液，滤过，浓缩至

1.5g/ml，备用。

2 方法

2.1 细胞培养：人乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231置于含10%胎小牛血清的DMEM培养液（含100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素）中，并在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。用0.25%胰蛋白酶消化，换液及传代。

2.2 模型制备：SPF级BALB/c裸鼠40只，常规饲养5天后采用左心室注射法[4]进行造模。取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞，制成单细胞悬液，按照文献方法[5]，调整细胞浓度为1×107/ml，裸鼠麻醉后左心室推注肿瘤细胞悬液，每只裸鼠接种量为1×107个细胞。注射后共有4只裸鼠死亡。

2.3 分组治疗：将36只裸鼠随机分为治疗组和模型组，每组18只，自造模后第2天起，参照《中药药理研究方法学》[6]计算人鼠等效剂量。治疗组每天予以大补元煎煎剂灌胃（浓度为1.5g/ml，相当于生药15g/kg/日），模型组予以等量的生理盐水灌胃。给药方法为0.4ml/d灌胃，每周连续给药5天，停药2天，共40天。

2.4 检测指标：摘眼球取血，离心制备血清备用；开胸取出肺组织，经过处理后在解剖显微镜下数出肺表面白色转移结节总数并计算抑制率。采用ELISA法检测裸鼠血清中MMP-1、MMP-9和VEGF含量。

2.5 统计学方法：采用SPSS16.0统计软件处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示；两样本间比较用t检验，P＜0.05作为差异显著性标准。

3 结果

3.1 裸鼠一般情况：模型组裸鼠精神萎靡，皮肤粗糙，饮食及活动量减少，2只出现瘫痪症状；治疗组裸鼠精神、饮食和活动度较模型组好，未见瘫痪。在治疗过程中，每组各有3只裸鼠死亡。治疗组平均体重19.84±1.02g,模型组17.46±0.86g,2组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。

3.2 裸鼠乳腺癌肺转移情况：瘤重抑制率=（模型组平均瘤重-治疗组平均瘤重/模型组平均瘤重×100%。肺转移瘤抑制率=（模型组平均肺转移结节数-治疗组平均肺转移结节数/模型组平均肺转移结节数×100%。与模型组比较，治疗组的平均瘤体重量、平均肺转移结节数量和体积均较小。见表1、图1。

表1 两组裸鼠肺转移情况比较

图1 裸鼠肺转移瘤图片

3.3 病理观察结果：转移瘤组织内可见大量异型性细胞，核大深染，有病理性核分裂现象。见图2。

图2 裸鼠正常肺和转移灶病理对比

3.4 两组MMP-1、MMP-9和VEGF含量：见表2。

表2 2组裸鼠血清MMP-1、MMP-9和VEGF含量比较（±s，ng/ml）

表2 2组裸鼠血清MMP-1、MMP-9和VEGF含量比较（±s，ng/ml）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

模型组治疗组5.96±0.83 5.35±0.81*17.18±3.44 13.54±3.56**15.61±1.97 13.12±1.55**

4 讨论

乳腺癌最容易的转移的靶器官是肺、骨、肝脏，在预后方面，内脏转移（肺和肝）预后最差。因此，研究乳腺癌肺转移的机制，并发现相应的有效药物显得尤为重要。肿瘤在侵袭转移的演变过程中，肿瘤组织通过多种途径来降解细胞外基质蛋白（ECM），并越过基质屏障导致肿瘤的浸润转移。基质金属蛋白酶（MMPs）在ECM的降解过程中起着重要的作用，其中MMP-1、MMP-9分布最广。研究发现MMP-1和MMP-9在乳腺癌患者中的水平要明显高于良性乳房疾病患者，且与淋巴结转移、恶性程度高、肿瘤复发有关。VEGF可以为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养[7]。因此上述蛋白和因子在肿瘤转移过程中发挥重要作用。

从中医学角度分析，乳腺癌术后患者多以气血亏虚，冲任失调，余毒未清为主要病机。“正气存内，邪不可干”，我们可以通过补益正气，从而减少可能出现的复发及转移的机会[8]。本研究采用的大补元煎方中党参大补元气，熟地、当归滋阴补血，枸杞、萸肉补益肝肾，杜仲温补肾阳，甘草助补益而调和诸药。全方补气血、调阴阳，扶养正气，拒邪内干，从而起到预防转移的作用。

通过本实验，我们发现中药治疗组能明显缩小裸鼠肺转移瘤，减少转移结节个数，且血清中MMP-1、MMP-9、VEGF的含量明显低于模型组。初步证实，益气补肾中药能可能通过抑制MMP-1、MMP-9、VEGF的表达，抑制新生肿瘤的血管生成，从而达到抑制乳腺癌细胞的肺转移。

5 参考文献

[1]张思维，雷正龙，李光琳，等.中国肿瘤登记地区2006年肿瘤发病和死亡资料分析[J].中国肿瘤，2010，19（6）：356-365．

[2]Hery M,Delozier T,Ramaioli A,et al.Natural history of node-negative breast cancer：are conventional prognostic factors predictor of time to relapse？[J].Breast,2002,11(5)：442-448．

[3]姚勇伟，朱飞叶，刘云霞，等.益气补肾法对裸鼠乳腺癌骨转移的作用及其机制研究[J].中华中医药学刊，2016，34(11)：1673-1677.

[4]李琼.骨高转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BM3及其动物模型的建立[J].肿瘤，2009,29(11)：1031-1035．

[5]Price JE,Polyzos A,Zhang RD,et al.Tumorigenicity and metastasis of human breast carcinoma cell lines in nude mice[J].Cancer Res,1990,50(3)：717-721.

[6]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，1996：33.

[7]Hanahan D,Folkman J.Patterns and emergine mechanisms of the angiogenics witch during tumor genesis[J].Cell,1996,86(3)：353-356.

[8]蒋沈君,刘云霞,杨洁文.自拟疏肝补肾方治疗乳腺癌相关骨质疏松症21例观察[J].浙江中医杂志,2015,50(7)：518.