血管瘤血管内皮细胞体外分离纯化方法的优化

稂翠玲 孙斌 雷红召 马玉春 董长宪

[摘要]目的：寻找更高效的婴幼儿血管瘤内皮细胞培养方法，为婴幼儿血管瘤的研究提供基础的科研保证。方法：选取增生期婴幼儿血管瘤手术标本，采用组织块贴壁法与酶消化法结合进行原代培养；二代细胞进行流式分选，取CD31阳性的细胞继续培养。分别进行细胞形态学观察、细胞表面标记物免疫荧光鉴定、细胞表面标记物流式鉴定。结果：培养48～72h清晰可见组织块周围细胞游出，细胞核清晰，细胞呈长梭形及多边形，2周左右部分可形成“血管腔样”结构，20d可铺满平传代；细胞流式测定CD31阳性率达98.4%，VWF与CD31双阳率90.3%，免疫荧光染色CD31、VWF均呈阳性表达。结论：组织块与消化结合法经流式分选后可获得高纯度的内皮细胞，为下一步研究婴幼儿血管瘤增生消退机制奠定了基础。

[关键词]婴幼儿血管瘤；细胞培养；流式分选；组织块与酶消化法；血管瘤内皮细胞

[中图分类号]R732.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）04-0061-03

Flow Separation was Combined with Tissue Block and Digestion to Train the Endothelial Cells of Hemangioma

LANG Cui-ling， SUN Bin， LEI Hong-zhao， MA Yu-chun， DONG Chang-xian

（Department of Hemangioma Surgery，Henan University Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou 450003，Henan，China）

Abstract： Objective To explore the endothelial cell culture method of more efficient infant hemangioma ，to provide the basic research guarantee for the research of hemangioma of infants. Methods In order to select the surgical specimens of the hemangioma of the hyperplasia， the primary culture was carried out by means of Tissue block adherent and enzyme digestion. Two generations of cells were selected for flow separation， and CD31 positive cells continued to be cultured.It were respectively carried out to observe the cell of morphology， immunofluorescence identification of cell surface marker， of fluid identification of cell surface marker. Results The cells in the tissue block around the tissue block could be clearly visible from 48-72 hours. The nuclei were clear， the cells were long fusiform and polygons， and the portion could form "blood vessel cavity" structure in about 2 weeks. The positive rate of CD31 was 98.4%， the VWF and CD31 were 90.3%， and the immunofluorescence staining CD31 and VWF were positive. Conclusion The high purity endothelial cells can be obtained after the flow separation of the means of tissue block and digestive association， which lays the foundation for the next study on the mechanism of proliferation and regression of hemangioma of infants.

Key words： infant hemangioma； cell culture ； flow separation；tissue block and enzyme digestion method； hemangioma endothelial cells

嬰幼儿血管瘤（Infantile hemangioma）是来源于内皮细胞的先天性良性肿瘤，好发于面颈部（60%）[1-2]，可造成皮肤色素沉着，瘢痕甚至畸形等，但其病因和发病机制目前并不清楚[3-4]，组织病理学证实血管瘤增生期可发现大量微血管内皮细胞增生[5-6]。婴幼儿血管瘤研究的标本大多数来源于病理组织，若进行分子生物学水平研究，则纯度不足。因此，要从细胞生物学、分子生物学研究血管瘤的发病机制、提纯目的细胞，婴幼儿血管瘤体外细胞培养是关键一步。本次实验采用组织块贴壁法与酶消化法结合，经流式细胞仪分选培养原代内皮细胞取得了较理想的结果，现将该方法报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验标本：3～6个月龄增生期婴幼儿血管瘤手术标本（由笔者医院提供），经临床及病理科医生确诊，伦理审查通过，已签知情同意书。

1.2 实验器材：手术刀、眼科剪、24孔板、血细胞计数板、离心机（湘仪 L1500）、超净台（美国）、倒置相差显微镜（日本）、5%CO2培养箱（美国）、水浴锅（金坛市华峰）、荧光显微镜（日本）、流式分选仪（Beckman Coulter Moflo- 美国）、流式检测仪（BD美国）等。

1.3 实验试剂：EGM-2培养基（美国）、胎牛血清（Hyclone，美国）、0.25%胰蛋白酶（Sigma，美国）、PBS液（索莱宝，国产）、兔抗人VWF单抗（Abcam，英国）、鼠抗人CD31单抗（Biolegend，美国）、DAPI（索莱宝，国产）、封片胶（美国）、破膜剂（翊圣，上海）、10%山羊血清（索莱宝，国产）、4%多聚甲醛、甲醇等。

1.4 方法

1.4.1 原代内皮细胞培养：将手术取出的新鲜标本放入含双抗的PBS液的离心管内，立即送到细胞室的超净台，用含双抗的PBS液冲洗3～5遍，液体直至肉眼观澄清液体为止；用手术刀切成约为3mm3大小的组织块，用PBS液洗2～3遍，然后用0.25%胰蛋白酶在37℃水浴锅振荡消化15～20min；眼科剪剪约为1mm3大小组织块放入培养瓶，置37℃、5%CO2培养箱4～6h后加入1.5ml含10%的FBS的EGM-2培养基进行培养，24h补加培养基。以后每隔1～2d换一次液。

1.4.2 细胞形态学观察：每日在倒置相差显微镜下观察培养内皮细胞的形态变化。

1.4.3 流式细胞分选：取二代内皮细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗一遍后CD31单抗（1︰200）室温孵育40～60min，进行细胞计数板计数（1×107/ml），用70μm的细胞过滤网进行过滤，移入流式管中，避光置冰上送分选室，进行分选，留取CD31阳性的细胞进行培养。

1.4.4 细胞生长观察：取分选CD31阳性的血管瘤内皮细胞进行消化，消化完成后，加入含20%胎牛血清培养液终止消化，轻轻吹打漩涡混匀后制成细胞悬液，制成单细胞悬液（1×105个/ml），接种于24孔板中，500μl/孔，再于每孔中加入1ml完全内皮细胞培养液，轻轻摇晃24孔板使细胞分散均匀，置培养箱中继续培养；设3个复孔，每隔1天随机选择3孔消化吹打并计数，取3孔平均值，以时间（d）为横轴，细胞数（1×104个/ml）为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.4.5 免疫荧光鉴定：将分选后培养（三代）的内皮细胞接种于放有细胞爬片的6孔培养板中进行培养待细胞长至80%后取出细胞爬片，PBS液清洗2～3次，4%的多聚甲醛固定10min；PBS液洗3次/3min；1.5% H2O2 37℃孵育15min；10%山羊血清室温，封闭30min；加入CD31单抗（1∶200）、VWF单抗（1∶500）避光，4℃过夜；PBS洗2～3遍/次，加入10%DAPI染细胞核；PBS液清洗后封片，免疫荧光显微镜观察，拍照。

1.4.6 流式细胞仪鉴定：将分选后培养（三代）的内皮细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，PBS液洗1～2遍/1min，1 000r/min离心10min，弃上清；计数板计数（5×105/ml）；加入CD31单抗（1∶100），室温孵育30min；80%甲醇4℃固定5min；1 000r/min离心10min，弃上清；PBS液洗2～3遍/1min，1 000r/min离心10min，弃上清；加入1.5ml破膜剂，室温，15min，1 000r/min离心10min，弃上清；10%山羊血清室温封闭30min后，VWF单抗（1∶300），1 000r/min离心10min，PBS液500μl重悬细胞，送至流式细胞鉴定。

2 结果

2.1 細胞形态学观察：培养48～72h组织块周围可见游离出细胞（见图1A），呈梭形、多边形，细胞核清晰；72h后去除组织，2周左右可见部分形成“血管腔样”结构（见图1B），20d左右瓶底铺满80%以上传代（见图1C）。

注：A.婴幼儿血管瘤内皮细胞从组织块爬出（3d）；B.婴幼儿血管瘤内皮细胞部分有形成“血管腔样结构”（14d）；C.原代婴幼儿血管瘤（2代）

图1 细胞形态学观察图（40×）

2.2 流式细胞分选：可见明显CD31阳性峰（见图2）。

图2 CD31 阳性分选

2.3 细胞生长曲线图：分选后细胞24h内无明显生长，48h开始增殖（3.58±0.1）×104个/孔，4～9d细胞分裂增殖加速（13.97±0.4）×104个/ 孔，逐渐进入对数生长期，10d以后进入平台期（16.75±0.05）×104个/孔，细胞计数无明显增加，此时，细胞生长稳定（见图3）。隔天在倒置相差显微镜下观察细胞形态并记录细胞数目，以时间为横轴，细胞数目为纵轴，绘制生长曲线。

图3 细胞生长曲线

2.4 免疫荧光鉴定：VWF可见阳性呈绿色荧光细胞（见图4A）；CD31阳性表达呈红色表达（见图4B）；VWF/CD31双阳为黄绿色，蓝色为细胞核（见图4C）。

注：A.VWF阳性表达；B.CD31阳性表达；C.VWF/CD31阳性表达

图4 免疫荧光鉴定图（100×）

2.5 流式细胞鉴定：CD31单阳性率达98.4%，CD31、VWF双阳性率90.3%见（见图5）。

注：A.空白（Q3阴性对照）；B.Q1为CD31阳性表达；C.Q2为CD31/VWF共表达；D.P2为CD31阴性区；E.P3为CD31阳性区

图5 流式细胞鉴定图

3 讨论

目前，对婴幼儿血管瘤的增殖和消退的确切机制尚不清楚[7-9]，组织病理学证实血管瘤是以血管内皮细胞增生为主与成纤维细胞、周细胞、脂肪细胞等多種细胞构成的良性肿瘤。从细胞水平、生物分子水平研究婴幼儿血管瘤的发病机制，需要有高效的方法分离获得高纯度的内皮细胞。本次实验采用的组织法与消化结合法，经流式细胞仪分选再培养可得到较高纯度的内皮细胞，有效去除组织中杂细胞，并通过细胞形态，细胞表面标记物免疫荧光鉴定，细胞表面标记物流式细胞鉴定为血管瘤内皮细胞。

培养原代细胞方法主要有消化法和组织块法[10-11]，消化法容易获得细胞但是血管瘤内皮细胞和杂细胞混合在一起不宜纯化；组织块法可得到纯度高的细胞易于纯化，但是得到细胞数量较少，细胞游出时间长，采用消化法和组织块法结合可取得较好的效果[12]。然而，在血管瘤内皮细胞培养过程中最关键的就是去除杂细胞对细胞进行分离、纯化。常用的分离纯化的方法有磁珠分选法[13-14]、流式分选法、酶消化法、机械刮除法[15]、差速贴壁法[16]等，机械刮除法和相差速贴壁法因过程较复杂目前较少用。流式细胞分选可得到较高纯度的细胞而且用时较短，可用三个字形容“快、精、准”，操作便捷、流程少、减少污染几率。流式分选与磁珠分选相比纯度及精确度更高。故本次研究采取消化法与组织块法结合，流式分选后经婴幼儿血管瘤内皮细胞表面标志物CD31鉴定纯度可达98.4%，CD31与VWF双阳率达90.3%。

流式分选使用时应注意几点要求：细胞的数量不低于1×106个/ml、抗体孵育时间30～60min、抗体要与细胞数量有一定的比例。但是由于代价较高、分选环境（相对无菌间）较高、细胞数量较多，故多在做分子、基因等对细胞纯度和数量有较高要求时，才选用此方法。然而，目前国内外对血管瘤的研究早已不再局限于细胞水平，已逐步拓展至分子、基因的层次。因此，传统的组织块法、消化法、组织块与消化法结合培养方法已不能满足研究需要，传统的内皮细胞培养方法与流式分选技术的结合，势在必行。

总之，本研究提供的婴幼儿血管瘤内皮细胞来源，使大家不仅能从细胞水平上研究婴幼儿血管瘤发病机制，而且在基因分子水平上进一步研究。另外联合组织块法、消化结合法和流式细胞分选技术进行原代血管瘤血管内皮细胞体外分离和纯化，操作过程简单、易行，可得到较高纯度的细胞，对下一步研究血管瘤内皮细胞生物学特性十分有利。

[参考文献]

[1]Léauté-Labrèze C，Prey S，Ezzedine K.Infantile haemangioma： Part I. Pathophysiology， epidemiology， clinical features， life cycle and associated structural abnormalities[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2011，25（11）：1245-1253.

[2]郑家伟，张凌，陈正岗，等.婴幼儿血管瘤的诊断与治疗[J].中国口腔颌面外科杂志，2015， 13（4）：289-296.

[3]血管瘤和脉管畸形诊断和治疗指南（2016版）[J].组织工程与重建外科杂志，2016，12（2）：63-93+97.

[4]郑家伟，张凌.婴幼儿血管瘤治疗理念与方法的转变[J].中华口腔医学研究杂志：电子版， 2015，2：1-4.

[5]叶晓星，肖海，陶超，等.小儿口唇部血管瘤临床病理分析[J].中国小儿血液与肿瘤杂志， 2016，21（3）：127-132.

[6]Callahan AB，Yoon MK.Infantile hemangiomas： A review[J].Saudi J Ophthalmol，2012，26（3）：283-291.

[7]翟亚楠，宋洪涛，陈少全，等.普萘洛尔凝胶治疗婴幼儿血管瘤的疗效观察[J].中华整形外科杂志，2013，29（1）：25-28.

[8]Léautélabrèze C，Dumas dl RE，Hubiche T，et al.Propranolol for severe hemangiomas of infancy[J].New England Med，2008，358（24）：2649.

[9]牛静静，徐广琪，吕仁荣，等.外涂普萘洛尔软膏治疗浅表型婴幼儿血管瘤疗效观察[J].中华整形外科杂志，2013，29（2）：100-103.

[10]李堂江，俞松，罗宇，等.p110、磷酸化蛋白激酶B及蛋白激酶B在体外培养血管瘤内皮细胞中的表达及意义[J].中华实用儿科临床杂志，2013，28（1）：73-75.

[11]Seghezzi G ，Patel S ，Ren CJ ，et al. Fibroblast growth factor-2（FGF-2）induces vascular endothelial growth factor（VEGF）expression in the endothelial Cells of forming capillaries：An autocrine mechanism contributing to angiogenesis[J].J Cell Biol，1998，141（7）：1659-1673.

[12]Jackson IT，Carre?o R，Potparic Z，et al. Hemangiomas， vascular malformations， and lymphovenous malformations：classification and methods of treatment[J]. Plast Reconstr Surg， 1993，91（7）：1216.

[13]Invernici G，Ponti D， Corsini E，et al. Human microvascular endothelial cells from different fetal organs demonstrate organ-specific CAM expression.[J].Exp Cell Res，2005，308（2）：273-282.

[14]马刚，林晓曦，金云波，等.婴幼儿血管瘤内皮细胞的分离、培养及鉴定[J].中华整形外科杂志，2008，24（2）：144-147.

[15]Mulliken JB，Zetter BR，Folkman J.In vitro characteristics of endothelium from hemangiomas and vascular malformations[J].Surgery，1982，92（2）：348-353.

[16]饶国洲，李昂，张引成，等.皮肤血管瘤内皮细胞原代分离培养与鉴定[J].现代检验医学杂志， 2009，24（5）：64-66.