大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞体外机械拉伸损伤模型的建立与评价

马祥+祁月红+卫建峰+李燕则+毕竞+吕磊+郭永清

[摘要]目的 采用FX-4000TTM柔性基底加載系统建立体外大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞机械拉伸损伤模型，为进一步探讨少突胶质前体细胞在脊髓损伤及修复过程中的作用及机制提供模型基础。方法 采用振摇法体外纯化培养大鼠脊髓少突胶质前体细胞，并进行免疫荧光细胞鉴定。将纯化培养3 d的少突胶质前体细胞随机分为A组（对照组）、B组（拉伸强度5%）、C组（拉伸强度10%）、D组（拉伸强度15%）。采用FX-4000TTM柔性基底加载系统机械拉伸少突胶质前体细胞2 h后，通过倒置显微镜观察各组细胞形态学改变、MTT法检测细胞存活率、双染流式细胞术检测细胞凋亡，对损伤模型进行评价。结果 体外成功培育少突胶质前体细胞且纯度>90%。B组拉伸强度对细胞形态及存活没有明显影响，基本不构成损伤。C组和D组细胞存活率较A组显著降低（P<0.05），凋亡率也明显升高（P<0.05），并出现明显病理性形态改变；但D组有明显的细胞脱落现象且细胞存活率降到<50%，不利于后续实验进行。结论 采用FX-4000TTM柔性基底加载系统以10%为拉伸强度可建立有效的少突胶质前体细胞机械拉伸损伤模型。

[关键词]少突胶质前体细胞；细胞培养；体外模型；机械拉伸；脊髓损伤

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）12（c）-0004-04

The establishment and evaluation of a model of stretch-induced mechanical injury on cultured oligodendrocyte precursor cells from neonatal rat spinal cord in vitro

MA Xiang1 QI Yue-hong2 WEI Jian-feng2 LI Yan-ze1 BI Jing1 LYU Lei1 GUO Yong-qing2

1.College of Anaesthesiology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.Department of Anaesthesiology，People′s Hospital Affiliated to Shanxi Medical University in Shanxi Province，Taiyuan 030012，China

[Abstract]Objective To establish a model of stretch-induced mechanical injury on cultured oligodendrocyte precursor cells （OPCs） in vitro with the FX-4000TTM system，in order to further explore the role and mechanism of OPCs in spinal cord injury and repair.Methods OPCs were separated from spinal cord of neonatal rats and then purified with the shaking method in vitro.Immunofluorescence assay was applied to identify the separated cells.A FX-4000TM system was used to apply cyclic stretch.The purified OPCs were randomly divided into four groups：group A （control group），group B （5% tensile strain），group C （10% tensile strain），group D（15% tensile strain）.After OPCs were strained for 2 h by the FX-4000TTM system，morphology of OPCs was observed by using inverted microscope，viability of OPCs was measured by MTT assay and apoptosis of the cells was detected by double staining flow cytometry，damage models were evaluated.Results The percentage of purified OPCs in vitro was more than 90%.There were no significant differences between group A and group B in survival rate and cell morphology.Compared with group A，survival rate of OPCs in group C and D was significantly decreased （P<0.05），apoptosis rate of OPCs was significantly increased （P<0.05），and obvious pathological morphologic changes of OPCs were also observed in group C and D.However，there was a large loss of cell attachment and survival rate of OPCs was found to be less than 50% in group D.Conclusion The model of stretch-induced mechanical injury on cultured OPCs can be established by applying 10% tensile strain with the FX-4000TTM system.

[Key words]Oligodendrocyte precursor cells；Cell culture；In vitro model；Mechanical strain；Spinal cord injury

随着现代交通和建筑工业的快速发展，脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的发病率逐年增加，并成为青年人致残的主要原因之一[1-2]。SCI是一种严重的中枢神经系创伤，其原发的机械损伤及贯序的炎症联级反应，均可导致少突胶质细胞大量死亡，引发广泛脱髓鞘病变，造成不可逆的神经功能缺失[3-4]。SCI后具有髓鞘修復能力的细胞主要是位于白质的少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs），它们能对SCI作出快速响应并增殖分化为具有髓鞘生成能力的成熟少突胶质细胞，参与SCI的修复[5-6]。因此，获得一种简单高效的OPCs培养方法，并建立其体外机械损伤模型，对进一步研究SCI后髓鞘修复及轴突再生的机制具有重要意义。

本研究培养大鼠脊髓OPCs并通过计算机控制的FX-4000TTM柔性基底拉伸系统建立体外细胞机械拉伸损伤模型，以期为进一步探讨SCI后OPCs增殖活化的机制建立实验基础。

1材料与方法

1.1实验动物

新生（出生48 h内）清洁级SD大鼠，由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2主要仪器和试剂

HERAcell 150i培养箱（Thermo Scientific，美国）、恒温定轨摇床（国华，上海）、IX73荧光倒置显微镜（OLYMPUS，日本）、FX-4000TTM柔性基底加载系统（Flexcell，美国）、伯乐680型酶标仪（Bio-rad，美国）、BD FACSCalibur流式细胞仪（BD，美国）。

胎牛血清（Gibco，美国）、DMEM（Gibco，美国）、少突胶质前体细胞培养基OPCM（含PDGF-AA和bFGF，Sciencell，美国）、胰蛋白酶（博士德，武汉）、多聚赖氨酸（Sigma，美国）、鼠抗A2B5抗体（Millipore，美国）、TRITC-免疫荧光二抗（博士德，武汉）、DAPI染色液（博士德，武汉）、MTT试剂（Sigma，美国）、Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒（生工，上海）。

1.3方法

1.3.1 OPCs的分离纯化培养与鉴定 本实验参考Chen等[7]的振摇法进行原代大鼠OPCs的体外培养。取新生48 h内SD大鼠脊髓，经胰蛋白酶消化15 min后中和消化，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基将细胞重悬并接种于预先多聚赖氨酸包被的75 cm2培养瓶中。培养至10 d时，可见大量的OPCs伏趴在星形胶质细胞上层。将培养瓶固定在37℃的恒温水平摇床上，200 r/min预震荡1 h以去除小胶质细胞；继续以200 r/min振摇过夜，取细胞上清接种于未包被的培养皿中孵育40 min以去除多余的星形胶质细胞和小胶质细胞，即可获得纯化的OPCs。使用OPCs培养基OPCM制备OPCs单细胞悬液，以1×105/cm2的密度接种于铺有多聚赖氨酸预包被盖玻片的6孔板中，每隔一天半量换液。

取纯化培养3 d的OPCs进行免疫荧光细胞染色。4%的多聚甲醛室温固定20 min，漂洗后，Triton X-100破膜，5%BSA室温下封闭30 min。加入稀释的A2B5抗体（1∶200）于4℃过夜，次日，PBS漂洗后加入TRITC-羊抗小鼠二抗（1∶100）避光孵育1 h，DAPI染核5 min，PBS洗涤后，抗荧光淬灭剂封片。荧光显微镜下做免疫荧光细胞鉴定。阴性对照组使用PBS替代一抗，其余步骤相同。

1.3.2 OPCs机械拉伸损伤模型的建立 本实验的细胞机械损伤系统由FX-4000TTM柔性基底拉伸装置和BioFlex培养板组成。取纯化的OPCs接种于多聚赖氨酸预包被的BioFlex培养板中培养3 d后，将培养板与FX-4000TTM柔性基底拉伸装置相连接，以实施对细胞的机械拉伸损伤。根据系统拉伸强度的大小，将实验分为A组（对照组）、B组（拉伸强度5%）、C组（拉伸强度10%）、D组（拉伸强度15%），加载时间都固定2 h，其他加载参数均为：频率0.1 Hz，正弦波。加载完成后于倒置显微镜下观察各组细胞形态。对照组同样接种在BioFlex培养板中与损伤组置于同一孵育箱，但不与拉伸装置相连。

1.3.3 MTT法检测细胞存活率 各组加载完成后，随即每孔加入MTT试剂150 μl，于培养箱中继续孵育4 h，培养终止后倒板。每孔加入DMSO 1.2 ml，37℃震荡15 min，使甲瓒结晶完全溶解。转移甲瓒溶液至96孔板，每组设6个复孔，于570 nm波长处测定各孔吸光度OD值。细胞存活率=损伤组OD值/对照组OD值×100%。

1.3.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡 各组加载完成后，随即每孔加入0.5 ml胰蛋白酶（不含EDTA），待细胞突起缩回中止消化，收集细胞，PBS洗涤2次。用Binding Buffer调整细胞密度为（1～5）×105/ml，加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混匀后再加入10 μl PI染液，室温避光孵育15 min，送流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4统计学处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey事后检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 OPCs体外培养的观察及鉴定

按振摇法纯化的OPCs经OPCM培养基培养3 d后，细胞呈圆形或光滑的椭圆形，细胞体积较小，折光性强，大多数具有典型的双极突起，少部分为三极突起（图1A）。进一步采用OPCs特异性抗体A2B5标记后，结果显示A2B5阳性细胞比例>90%（图1B），阴性对照未见荧光。

2.2 OPCs拉伸损伤后病理形态学观察

机械损伤前后，相差显微镜下可见OPCs发生明显形态学变化。对照组OPCs贴壁良好，突起伸展自然，折光性强，形态正常（图2A）。5%形变拉伸后，B组OPCs形态饱满，细胞间隙略有增大，与A组无明显差异（图2B）；10%形变拉伸后，C组细胞可见有部分包体肿胀，胞质折光减弱，突起略有拉长，但细胞仍然附着于硅胶膜上不脱落（图2C）；15%形变拉伸后，D组细胞胞体变圆，突起断裂，呈无极性散在分布，细胞脱落严重（图2D）。

2.3 OPCs拉伸损伤后细胞存活率的變化

MTT法测定损伤后细胞存活率，A组细胞存活率为（99.93±4.03）%，B组为（95.48±7.66）%，C组为（72.97±8.89）%，D组为（45.05±4.816）%。5%拉伸强度对B组细胞存活率并无明显影响；与A组细胞相比，C组和D组细胞存活率显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。但D组由于力学荷载过大致使细胞存活率降到<50%，不利于后续实验进行。

2.4 OPCs拉伸损伤后细胞凋亡率的变化

流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，A组凋亡率为（3.69±1.14）%，B组为（4.91±1.52）%，C组为（15.28±2.01）%，D组为（33.01±4.15）%。B组细胞凋亡率和A组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；C组和D组随着拉伸强度的增加细胞凋亡率逐渐增加，均明显高于A组（P<0.05）。

3讨论

OPCs是具有干细胞特性的未成熟少突胶质细胞，20世纪80年代初被Raff等[8]首次发现后至今，因其既能定向诱导分化为成熟少突胶质细胞，同时又具有良好的增殖迁移能力，故一直是SCI后治疗的研究热点[9-10]。笔者通过体外培养获得了高纯度OPCs，并使用细胞拉伸损伤模型合理地模拟了SCI对OPCs的原发性损害，为进一步探讨OPCs在脊髓的损伤及修复过程中的作用及机制提供实验工具。

目前已报道的OPCs体外培养的方法有很多，包括振摇法、免疫吸附法、干细胞克隆球诱导分化法等[7，11-12]，笔者综合比较了几种方法后采用振摇法，规避了前几种方法操作复杂、成本高昂、产率低等缺陷，从大鼠乳鼠脊髓中获得纯度较高且增殖旺盛的OPCs。随着神经细胞分离培养技术的日趋成熟，体外机械损伤的细胞模型已广泛用于SCI的研究中，但关于OPCs的机械损伤模型报道尚少。离体损伤模型相对于动物模型更有利于实验条件的精确控制和对细胞内事件的深入研究，是探索SCI发病机制和治疗方案的有效手段[13]。目前常用的神经细胞机械损伤模型有切割损伤模型、牵张损伤模型、压迫损伤模型、液压动力损伤模型、加速/减速损伤模型等，可以分别通过切割、拉伸与挤压、剪切等方式来模仿神经损伤的不同形式[14-16]。在SCI的研究中人们发现，亚致死量损伤的神经细胞可以激发二次损伤的信号通路，是继发性损伤的主要受累细胞，故亚致死的神经元是目前人为干预治疗的最佳目标。与其他损伤模型相比，由FX-4000TTM柔性基底加载系统建立的拉伸损伤模型是目前公认的研究亚致死量损伤的最佳选择[17-18]。FX-4000TTM柔性基底加载系统可以为细胞提供均匀可控的周期性应力，使细胞在损伤过程中同时承受压缩和拉伸的应力变化[19-20]，可较为接近地模拟真实SCI过程。

如前所述，笔者采用了5%、10%、15%三个拉伸强度去打击细胞，为评价损伤程度又观察了细胞病理形态、检测了受损细胞的存活率和凋亡情况。通过这种方式制作的细胞机械损伤模型，笔者观察到OPCs不仅出现了形态学的病理变化，还出现了细胞存活率的降低和凋亡率的显著增高，这些结果都证明此损伤模型是制作成功的。但是，笔者发现15%拉伸强度的重度损伤，细胞存活率已下降超过一半，细胞大面积脱落，对细胞的打击是毁灭性的，不利于后续实验的进行。一般来说，急性拉伸强度>11%会引起神经元严重的不可逆损害，事实上，神经细胞一般都承受不了11%这个阈值[21]。然而，6%以下拉伸强度所引起的神经细胞改变是生理性的[22]。有研究表明，在5%的拉伸刺激下，雪旺细胞的增殖指数要明显高于对照组，提示接近生理性拉伸应变可能提高细胞活性。本研究中发现，在5%拉伸强度下，OPCs凋亡和细胞活性基本与A组无异，推测5%的拉伸应变对OPCs来说可能也属生理性刺激。然而SCI时瞬间的冲力所造成的创伤往往不是生理性刺激，故5%的轻度拉伸并没有达到损伤标准，不能作为建模的有效损伤强度。5%拉伸接近生理性刺激对OPCs基本不构成损伤；15%拉伸强度由于力学荷载过大对OPCs造成毁灭性打击；而10%拉伸组细胞损伤明显且无脱落现象，有利于后续实验进行，故笔者初步确定10%为OPCs机械损伤模型的拉伸强度，并作为进行下一步研究的实验依据。

总之，本文在脊髓OPCs体外纯化培养的基础上，建立了简单而又行之有效的OPCs机械拉伸损伤模型，为细胞水平研究SCI提供了科学的保证。然而，SCI后OPCs发生凋亡和坏死的机制目前还不甚清楚，有学者认为细胞周期相关蛋白失衡是导致OPCs凋亡的重要原因之一，其具体机制还有待于进一步研究。

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