采用Percoll液纯化分离贮精腺细胞试验

徐鑫

摘要 以新扬州鸡为素材，用胶原酶/透明质酸酶和各梯度浓度的Percoll液的方法分离子宫阴道交接处（UVJ）的贮精腺细胞并进行细胞培养以达到细胞纯化的目的，旨在建立鸡贮精腺细胞纯化分离和培养技术，为进一步研究和分析贮精腺的构造和功能，以及调控机理的研究提供技术平台。结果表明：用胶原酶/透明质酸酶分离培养，消化45 min，100目过滤的贮精腺细胞用Percoll液原代培养至少存活120 h，细胞的纯化效果很明显。

关键词 新扬州鸡；Percoll液；透明质酸酶；贮精腺；纯化；细胞培养

中图分类号 Q50 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0233-01

动物细胞培养开始于20世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为医学、生物研究和应用中广泛采用的技术方法，具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等可通过利用动物细胞培养生产，这已成为医药生物高技术产业的重要部分[1]。

动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比有显著差别：①動物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；②培养过程需氧量少；③倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；④原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；⑤培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高[1-5]。

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低（<20 mosm/kg H2O），黏度也很小，可形成高达1.3 g/mL密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力[（200～1 000）g]于数分钟至数十分钟内达到满意的细胞分离结果[6-9]。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定[10-15]。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因而广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离[16]。

家禽输卵管由漏斗部、膨大部、峡部、子宫部和阴道部组成[11]，阴道部较短，呈“S”状弯曲，其中子宫阴道交接部存在一种特殊的管状腺，该腺体由单层柱状上皮细胞构成，腺管细胞顶部无纤毛，细胞核排列整齐，位于细胞的基部，因精子在此贮存而被称为贮精腺[12]，贮精腺的存在使禽类精子在输卵管内可以长期存活，一般为2～3周，并能长时间保持受精能力[12-13]。本次试验用新扬州鸡为素材，用胶原酶/透明质酸酶消化分离子宫阴道交接处（UVJ）的贮精腺细胞[16-19]，并用各梯度浓度的Percoll液纯化贮精腺细胞，旨在建立鸡贮精腺细胞纯化分离和培养技术，为贮精腺调控机理的研究提供技术平台。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用4只处于盛产期的新扬州鸡贮精腺为素材，采用胶原酶/透明质酸酶消化分离子宫阴道交接处（UVJ）的贮精腺细胞，并用各梯度浓度的Percoll液纯化贮精腺细胞[20-24]。

试验仪器和试验试剂有无菌室和无菌操作台，体视显微镜，天平（称量所取组织或黏膜），离心机，台式天平（离心时平衡用），铝盒1个（盛器皿），大瓷盘1个（采样用），小瓷盘1个（装冰用），大剪刀1把（剖鸡），解剖剪2把（剪子宫阴道部），解剖刀2把，眼科剪2把（将组织剪成小块），小镊子4 把，小培养皿6个，西林瓶6个，废液瓶1个（500 mL烧杯代替），100目过滤筛1个，0.1%明胶预处理过的4孔细胞培养板若干个，吸管20支，50～100 mL三角瓶（或称锥形瓶）2个，10 mL试管2个（套帽），红血球计数板，载玻片，盖玻片，1 000、100、10 μL枪各1把，10 mL试管8个（套帽）。胶原酶/透明质酸酶无菌PBS（pH值7.2～7.4），DMEM 培养液，灭活血清，酒精棉，庆大霉素1支，台盼蓝染液。各梯度浓度的 Percoll。

1.2 试验方法

胶原酶/透明质酸酶、培养液DMEM、碎冰入无菌室内，无菌室和无菌操作台用紫外线消毒0.5～1.0 h。酒精棉消毒大瓷盘、大剪刀、镊子、解剖剪各1把入解部室，用时再酒精灯消毒。庆大霉素1支（80万U）入消过毒的PBS。鸡固定于大瓷盘，大剪刀剖1只鸡腹，暴露生殖道，用镊子夹住子宫阴道部，解剖剪剪下UVJ入含PBS的培养皿。纵剖UVJ，并纵向分成2个部分，入无菌室。洗涤入另一PBS培养皿，去结缔组织。无菌操作台内解剖剪剪碎，入含PBS培养皿。无菌操作台内将样品、吸管用酒精灯消毒。用吸管吹打样品管，吸PBS入废液瓶。换吸管并用酒精灯消毒。用吸管加胶原酶/透明质酸酶20 mL入三角瓶，加5 mL DMEM。置37 ℃水浴锅内振荡消化45 min，入碎冰盘终止消化。同时做4个梯度离心管：灭活血清将10 mL离心管润洗1次，每个离心管用1 000 μL枪依次取1 mL 70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%的Percoll液入10 mL离心管（注意离心管内Percoll液体从底部至顶部依次从高浓度到低浓度，各层不得相互混合）。100目过滤入三角瓶，吸管吸入10mL离心管，盖帽，1 000 r/min 7～8 min，洒精棉擦离心管外壁四周，无菌操作台内消毒试管，上清液入废液瓶，换吸管并用酒精灯消毒[25-26]。下层细胞用DMEM稀释（用1 mL枪吸DMEM培养基入试管，总用量为5 mL）。先取DMEM入1个试管，吸打并移入另一试管，两者混合吹打均匀成细胞悬液。在4个梯度离心管顶层加1 mL分离的细胞液，盖帽。从超净台内取出。以1 400～2 500 r/min离心25 min。100 μL枪收集每层细胞置10 mL离心管，加5倍（下转第236页）

（上接第233页）

体积PBS洗涤，以1 000 r/min离心10 min。重复洗涤1次。加1 mL DMEM重悬细胞。用枪取10 μL细胞至载玻片，用体视显微镜观察，照相；10 μL样于10 μL 0.4%台盼蓝染色，计数死活细胞数。 细胞原液、各层纯化的细胞调整密度至3×106个/mL，4孔培养板培养。板孔底部最好不要有气泡，可用吸管将气泡吸出，盖上瓶盖。标记日期及样品名称，移至38.5 ℃的CO2培养箱，进行细胞培养。

2 结果与分析

试验结果表明，胶原酶/透明质酸酶，Percoll液纯化分离，消化45 min，100目过滤的贮精腺细胞的细胞纯度很高（圖1），基本都是所需要的细胞，细胞数目多，完整性好，贴壁效果好，比没用Percoll液分离的效果更加明显更清楚，更加有利于进一步分离培养。

3 结论与讨论

密度梯度离心技术是早期应用的一种细胞分离、纯化的方法，是Brakke于1951年提出来的，其基本原理是利用离心溶液介质所形成的密度梯度来维持重力的稳定性和抑制对流，待分离颗粒的密度在离心溶液的梯度柱密度范围内，经过一定时间离心后，不同密度的颗粒分别集中在离心溶液某密度带上而得以分离[16]。Percoll细胞分离液是一质优的分离介质，与Ficoll相比其黏度低、稳定，对细胞无毒害作用，颗粒大易于从细胞表面洗脱下来，更重要的是Percoll在高速离心（>10 000 r/min）时可产生连续梯度，利用这一特点先处理细胞悬浊液，光镜下几乎没见到细胞间的聚集。Percoll液颗粒大小不一，离心后可形成一定的密度梯度，不同密度的细胞分布于不同密度的层内，借此可将贮精腺细胞和杂细胞及细胞碎片分离。本试验利用Percoll密度梯度离心法快速稳定，而且便于提纯和体外培养，细胞成活率高，取得了比较满意的效果。

本试验结果表明，用Percoll细胞分离液和胶原酶/透明质酸酶分离贮精腺细胞的效果非常明显，纯度很高，并且分离出的细胞继续培养的效果也很好，这2种试剂组合有利于细胞的分离培养，为进一步研究贮精腺的机理奠定了基础。

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