细胞支原体巢式PCR检测方法的建立及应用

黄海军+高其双+彭霞等

摘要：动物生物制品生产过程中细胞（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。细胞支原体污染可显著影响生产用细胞的培养及生物功能的发挥，最终影响生物制品的生产，给生物制品企业造成巨大损失，建立高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要。建立了一种支原体巢式PCR检测方法，该方法高效、快速、灵敏，可以最大限度降低假阴性和假阳性结果的出现。该方法的建立对培养细胞、动物疫苗等生物制品企业的检测标准化管理有一定的借鉴意义。

关键词：支原体；细胞培养；巢式PCR；生物制品

中图分类号：S858.28；Q95 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0690-03

细胞培养过程中支原体污染主要来源于所使用的动物源的一些培养材料，如血清、已被支原体污染的细胞株（系）或者是经操作人员传播。污染培养细胞的支原体一般有寄生于人、牛、猪或狗的少数几种类型。细胞培养液中支原体的浓度可达1×107个/mL，而不管是肉眼观察还是普通显微镜下观察，受支原体污染的细胞状态并无明显变化[1]。但是，越来越多的研究表明，支原体感染发生后能改变细胞的DNA、RNA及蛋白表达，使研究结果的真实性和可靠性大大下降[2，3]。由于竞争营养及支原体有毒的代谢产物，支原体污染可显著影响生产用细胞的培养及相应生物学功能的发挥，影响生物制品的质量。细胞被支原体污染长期困扰着疫苗（特别是生产弱毒苗）的生产企业，增加了企业生产、投资的风险，特别是在竞争日益激烈的当代社会，这种风险对疫苗生产企业来说通常是致命的。因此，建立一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要。

目前，普遍公认的细胞支原体污染检测方法为分离培养法，该方法耗时、敏感性低，甚至可能出现二次污染，影响结果的判断。随着分子生物学的发展，PCR方法已经成为一种常用的有效检测培养困难和抗原性复杂的微生物的方法[4，5]。本研究建立了一种细胞支原体巢式PCR检测方法，最大限度降低了假阴性和假阳性结果的出现，以期为完善细胞支原体的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种：猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）济南系强毒（菌号CVCC354）购自中国兽医药品监察所。

供试试剂与仪器：Taq DNA polymerase（2.5 U/μL）、10×PCR Buffer、dNTP（2.5 mmol/L）、DNA凝胶回收与纯化试剂盒购自武汉天源生物技术公司，对比用支原体PCR检测试剂盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）由以色列BI公司生产。9700型PCR 仪由美国ABI公司生产。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 根据12种常见类型支原体（M. hyorhinis、M. orale、M. hyopneumoniae、M. arginini、

1.2.2 PCR检测方法的建立

1）阳性PCR模板的制备：将猪肺炎支原体培养液沸水水浴10 min，再3 000 r/min离心10 min，取上清液作为支原体阳性PCR扩增的阳性模板。

2）阳性支原体的检测：第一轮PCR反应体系25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，阳性引物Myc-F1和Myc-R1（10 μmol/L）各0.5 μL，阳性模板1 μL，Taq DNA 酶（2.5 U/μL） 0.25 μL，加ddH2O至25 μL。同时以ddH2O为阴性对照。反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 10 min。第一轮PCR反应结束后，取1 μL PCR产物作为第二轮PCR反应的模板，反应体系其他成分及反应条件同第一轮PCR。分别取第一轮和第二轮PCR反应产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后对目的片段进行纯化，作为PCR阳性模板备用。

3）阳性Mhp模板稀释倍数的确定：按1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6浓度梯度稀释Mhp阳性产物，固定体系其他成分不变进行PCR反应。反应结束后，取10 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，选择最适浓度作为Mhp阳性标准品。

4）反应条件的优化：Taq DNA 酶最适使用量的确定，按最适引物浓度，优化Taq DNA 酶 （2.5 U/μL）的使用量，分别为0.125、0.25、0.5 μL；dNTP最适使用量的确定，反应体系中dNTP（2.5 mmol/L）的使用量分别为1、2、3 μL。反应体系中其他成分和反应条件均不改变。反应结束后，取PCR反应产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，确定最适浓度配比。

1.2.3 应用 从武汉某疫苗生产车间随机选取3个批次共10个疑似支原体污染的样本，收集细胞培养上清液。3 000 r/min离心5 min，沉淀培养液中残留的细胞，然后取上清液5 μL备用。按本研究建立的巢式PCR反应体系及条件，对各样本的两种平行样品进行检测。并将结果与EZ-PCR Mycoplasma 检测结果进行比对。将两种方法检测为阳性的样品依次进行10-1～10-4梯度稀释，分别用本研究建立的方法和支原体PCR检测试剂盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）进行检测，比较两者的灵敏度。将本方法诊断阳性的样品进行病原培养，验证其检测准确性。

2 结果与分析

2.1 阳性标准品的建立

经PCR扩增得到654 bp的Mhp基因片段，与预期结果相符（图1）。测定回收的Mhp阳性模板浓度为13.6 μg/mL，结果表明， Mhp阳性模板的稀释倍数为1×10-5 时，条带清晰（图1），考虑到检测条件及产物的稳定性，将标准品浓度定为2×10-4 μg/mL，即0.2 ng/mL。

2.2 巢式PCR反应体系的优化

在反应条件及体系其他成分不变的同时，分别对Taq DNA酶和dNTP使用量进行优化，并根据第一次和第二次PCR扩增结果，确定反应体系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分别为0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR检测方法的应用

用所建立的巢式PCR检测方法对收集的10个疑似支原体污染样品进行检测，第一轮PCR扩增结果和第二轮扩增结果分别见图2和图3。

将PCR产物回收送上海生工生物工程有限公司测序，并与Genbank中登录的相关序列进行比对，结果分别为100%、99.26%、99.19%和99.19%。最终确定2号样品为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）阳性，7号样品为口腔支原体（Mycoplasma orale）阳性，4号样品和8号样品均为猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）阳性。该结果与BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 检测结果完全一致。

将4个检测为阳性的样品依次进行10-1～10-4倍梯度稀释，再作为模板，分别用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit进行检测，结果表明，2种方法均可检测到稀释10-3倍的模板，符合率达100%。

3 小结与讨论

支原体是一种介于细菌和病毒之间的能独立生存的最小微生物，直径0.1～0.3 μm，因无细胞壁故具有可塑性，可通过滤菌器，对于一般抗生素的耐受更使其难以清除，是细胞培养污染的一个重要因素[6]。动物疫苗生产过程中细胞（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。已有许多调查及研究显示，美国和欧洲正在使用的细胞系中的支原体污染率为10%～15%[7]，德国微生物和培养细胞保藏中心（DSMZ）的研究显示，世界范围内细胞系的支原体污染率在15%～50%[8，9]，而国内使用的细胞系中的支原体的污染更为严重，使得生物制品企业面临的形势极为严峻[1]。

支原体感染细胞后，并不引起细胞形态及功能的急性改变，不易被察觉，但是细胞支原体污染却给疫苗生产带来致命打击。因此，在疫苗生产早期对细胞支原体污染进行监测具有重要意义。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究发现，PCR检测支原体的引物选用16S rRNA序列保守区，难以在保证特异性强的情况下扩增出所有常见支原体污染种别的DNA，导致假阴性结果的出现。本研究根据常见支原体16S～23S间隔区种别特异性序列，设计2对用于巢式扩增支原体的引物，可以准确检测12种常见支原体，这12种常见支原体代表了98%以上的细胞支原体污染源。本方法检测整个过程耗时不超过6 h，且设置了阴性对照和阳性对照标准品，避免了假阴性和假阳性，检测结果与以色列BI公司支原体PCR检测试剂盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和传统培养法鉴定结果相一致，也证实了其检测的可靠性和灵敏性。因此，该方法有望在细胞培养、动物疫苗等生物制品企业的检测标准化管理中得到广泛应用。

参考文献：

[1] 刘玉琴.体外培养细胞工作中支原体污染及对策[J].中华病理学杂志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

[3] SCHMIDHAUSER C， DUDLER R， SCHMIDT T， et al. A mycoplasmal protein influence tumor cell invasiveness and contact inhibition in vitro[J]. J Cell Sci，1990，95：499-506.

[4] 戴 悦，吕允威，张春凤，等.细胞系中支原体检测及分型[J].北京大学学报（医学版），2005，37（2）：207-210.

[5] 甘一迪，王银银，任芳丽，等.培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用[J].中国医药生物技术，2011，6（4）：295-298.

[6] FLEEKENSTELN E， UPHOFFC C C， DREXLER H G. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enrofloxacin （Baytril）[J]. Leukemia，1994，8（8）：1424-1434.

[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.

2.2 巢式PCR反应体系的优化

在反应条件及体系其他成分不变的同时，分别对Taq DNA酶和dNTP使用量进行优化，并根据第一次和第二次PCR扩增结果，确定反应体系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分别为0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR检测方法的应用

用所建立的巢式PCR检测方法对收集的10个疑似支原体污染样品进行检测，第一轮PCR扩增结果和第二轮扩增结果分别见图2和图3。

将PCR产物回收送上海生工生物工程有限公司测序，并与Genbank中登录的相关序列进行比对，结果分别为100%、99.26%、99.19%和99.19%。最终确定2号样品为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）阳性，7号样品为口腔支原体（Mycoplasma orale）阳性，4号样品和8号样品均为猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）阳性。该结果与BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 检测结果完全一致。

将4个检测为阳性的样品依次进行10-1～10-4倍梯度稀释，再作为模板，分别用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit进行检测，结果表明，2种方法均可检测到稀释10-3倍的模板，符合率达100%。

3 小结与讨论

支原体是一种介于细菌和病毒之间的能独立生存的最小微生物，直径0.1～0.3 μm，因无细胞壁故具有可塑性，可通过滤菌器，对于一般抗生素的耐受更使其难以清除，是细胞培养污染的一个重要因素[6]。动物疫苗生产过程中细胞（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。已有许多调查及研究显示，美国和欧洲正在使用的细胞系中的支原体污染率为10%～15%[7]，德国微生物和培养细胞保藏中心（DSMZ）的研究显示，世界范围内细胞系的支原体污染率在15%～50%[8，9]，而国内使用的细胞系中的支原体的污染更为严重，使得生物制品企业面临的形势极为严峻[1]。

支原体感染细胞后，并不引起细胞形态及功能的急性改变，不易被察觉，但是细胞支原体污染却给疫苗生产带来致命打击。因此，在疫苗生产早期对细胞支原体污染进行监测具有重要意义。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究发现，PCR检测支原体的引物选用16S rRNA序列保守区，难以在保证特异性强的情况下扩增出所有常见支原体污染种别的DNA，导致假阴性结果的出现。本研究根据常见支原体16S～23S间隔区种别特异性序列，设计2对用于巢式扩增支原体的引物，可以准确检测12种常见支原体，这12种常见支原体代表了98%以上的细胞支原体污染源。本方法检测整个过程耗时不超过6 h，且设置了阴性对照和阳性对照标准品，避免了假阴性和假阳性，检测结果与以色列BI公司支原体PCR检测试剂盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和传统培养法鉴定结果相一致，也证实了其检测的可靠性和灵敏性。因此，该方法有望在细胞培养、动物疫苗等生物制品企业的检测标准化管理中得到广泛应用。

参考文献：

[1] 刘玉琴.体外培养细胞工作中支原体污染及对策[J].中华病理学杂志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

[3] SCHMIDHAUSER C， DUDLER R， SCHMIDT T， et al. A mycoplasmal protein influence tumor cell invasiveness and contact inhibition in vitro[J]. J Cell Sci，1990，95：499-506.

[4] 戴 悦，吕允威，张春凤，等.细胞系中支原体检测及分型[J].北京大学学报（医学版），2005，37（2）：207-210.

[5] 甘一迪，王银银，任芳丽，等.培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用[J].中国医药生物技术，2011，6（4）：295-298.

[6] FLEEKENSTELN E， UPHOFFC C C， DREXLER H G. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enrofloxacin （Baytril）[J]. Leukemia，1994，8（8）：1424-1434.

[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.

2.2 巢式PCR反应体系的优化

在反应条件及体系其他成分不变的同时，分别对Taq DNA酶和dNTP使用量进行优化，并根据第一次和第二次PCR扩增结果，确定反应体系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分别为0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR检测方法的应用

用所建立的巢式PCR检测方法对收集的10个疑似支原体污染样品进行检测，第一轮PCR扩增结果和第二轮扩增结果分别见图2和图3。

将PCR产物回收送上海生工生物工程有限公司测序，并与Genbank中登录的相关序列进行比对，结果分别为100%、99.26%、99.19%和99.19%。最终确定2号样品为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）阳性，7号样品为口腔支原体（Mycoplasma orale）阳性，4号样品和8号样品均为猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）阳性。该结果与BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 检测结果完全一致。

将4个检测为阳性的样品依次进行10-1～10-4倍梯度稀释，再作为模板，分别用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit进行检测，结果表明，2种方法均可检测到稀释10-3倍的模板，符合率达100%。

3 小结与讨论

支原体是一种介于细菌和病毒之间的能独立生存的最小微生物，直径0.1～0.3 μm，因无细胞壁故具有可塑性，可通过滤菌器，对于一般抗生素的耐受更使其难以清除，是细胞培养污染的一个重要因素[6]。动物疫苗生产过程中细胞（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。已有许多调查及研究显示，美国和欧洲正在使用的细胞系中的支原体污染率为10%～15%[7]，德国微生物和培养细胞保藏中心（DSMZ）的研究显示，世界范围内细胞系的支原体污染率在15%～50%[8，9]，而国内使用的细胞系中的支原体的污染更为严重，使得生物制品企业面临的形势极为严峻[1]。

支原体感染细胞后，并不引起细胞形态及功能的急性改变，不易被察觉，但是细胞支原体污染却给疫苗生产带来致命打击。因此，在疫苗生产早期对细胞支原体污染进行监测具有重要意义。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究发现，PCR检测支原体的引物选用16S rRNA序列保守区，难以在保证特异性强的情况下扩增出所有常见支原体污染种别的DNA，导致假阴性结果的出现。本研究根据常见支原体16S～23S间隔区种别特异性序列，设计2对用于巢式扩增支原体的引物，可以准确检测12种常见支原体，这12种常见支原体代表了98%以上的细胞支原体污染源。本方法检测整个过程耗时不超过6 h，且设置了阴性对照和阳性对照标准品，避免了假阴性和假阳性，检测结果与以色列BI公司支原体PCR检测试剂盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和传统培养法鉴定结果相一致，也证实了其检测的可靠性和灵敏性。因此，该方法有望在细胞培养、动物疫苗等生物制品企业的检测标准化管理中得到广泛应用。

参考文献：

[1] 刘玉琴.体外培养细胞工作中支原体污染及对策[J].中华病理学杂志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

[3] SCHMIDHAUSER C， DUDLER R， SCHMIDT T， et al. A mycoplasmal protein influence tumor cell invasiveness and contact inhibition in vitro[J]. J Cell Sci，1990，95：499-506.

[4] 戴 悦，吕允威，张春凤，等.细胞系中支原体检测及分型[J].北京大学学报（医学版），2005，37（2）：207-210.

[5] 甘一迪，王银银，任芳丽，等.培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用[J].中国医药生物技术，2011，6（4）：295-298.

[6] FLEEKENSTELN E， UPHOFFC C C， DREXLER H G. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enrofloxacin （Baytril）[J]. Leukemia，1994，8（8）：1424-1434.

[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.