高效液相色谱法测定甘草锌颗粒中甘草酸的含量

孟庆山 王嘉伟 楚合法 邢 燕 巩腾飞

（威海市食品药品检验检测中心，山东 威海 264200）

甘草锌颗粒是应用于临床的抗溃疡和补锌药物之一，其主要成分为甘草根提取物甘草酸与锌结合的生成的药物，具有抗炎、消肿、收敛及促进黏膜再生和加速溃疡愈合的作用，可用于缺锌引起的儿童厌食、生长发育不良，寻常型痤疮，口腔溃疡及成人锌缺乏症等[1]。该药中甘草酸含量测定的标准方法，采用聚酰胺柱层析-紫外法[2]，早期也出现过薄层色谱法、重量法、气相色谱法、比色法，但是这些方法测定甘草酸含量操作繁琐，重现性差，近年来国内外报道有高效液相色谱法[3]，《中国药典》2015年版一部中，甘草酸含量测定也普遍采用了高效液相色谱法，本文以甘草酸铵为外标，用HPLC法测定甘草锌颗粒中甘草酸的含量，结果标明，此法操作简单，甘草酸与相邻峰有较好的分离度，结果准确，重现性好。

1 仪器与试药

1.1 仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪（LC Solution工作站）；岛津UV-2401PC型紫外-可见分光光度计；梅特勒MS105DU型电子天平；梅特勒FE20 Plus型pH计

1.2 试药：甘草酸铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110731-201116，含量93.1%）；甘草锌颗粒（厂家A，批号150702，160803，160904），甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：InertSustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，序列号：SN 4CR98043）；流动相为甲醇-1%的醋酸溶液（用氨水调pH至4.0）（66∶34）；流速为1.0 mL/min；检测波长252 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加流动相溶解并制成含甘草酸浓度为25.9 μg/mL的溶液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取装量差异项下的供试品，研细，取约0.25 g，精密称定，置200 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液按甘草锌颗粒处方比例制备不含甘草锌的阴性样品，照“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验及专属性试验：《中国药典》2015年版一部中采用HPLC法测甘草酸的含量，检测波长既有采用250 nm[4]，也有采用252 nm[5]，本文取“2.2.1”项下对照品溶液，用紫外-可见分光光度计在190～400 nm范围内进行全波长扫描，该溶液在252 nm处有最大吸收，见图1。故本文建立的色谱条件下选用252 nm作为检测波长。

图1 紫外吸收光谱图

取对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。结果表明，供试品色谱图中主峰保留时间与对照品色谱图主峰保留时间一致；阴性样品对甘草酸的测定无干扰；供试品甘草酸峰的理论塔板数为3600，与相邻峰的分离度分别为2.3，3.0，满足定量要求，见图2。

表1 加样回收试验结果

图2 HPLC色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察：分别精密吸取对照品溶液2、6、10、14、18、22 μL，按上述条件分别注入液相色谱仪测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，求得回归方程为Y=2.3229×104X-1.1495×103，r=1.0000，结果表明，进样量在0.0518～0.5698 μg范围内呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验：精密吸取对照品溶液10μL，按“2.1”所述色谱条件，连续进样6次，测的甘草酸的峰面积的RSD为0.24%结果表明精密度良好。

2.4.3 重复性试验：取同一批样品（批号：160803），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进行测定。结果甘草酸平均含量为17.68 mg/g，其RSD为0.53%。

2.4.4 供试品溶液稳定性考察：取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 h进样测定甘草酸的峰面积。所得峰面积的RSD为0.20%。结果表明，供试品溶液室温放置36 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收试验：精密称取已知含量的同一批样品（批号：160803）约0.13 g，共6份，分别精密加入对照品溶液（以甘草酸计，浓度为1.0 mg/mL）2 mL，按供试品溶液制备方法制备，依法测定甘草酸的含量，计算加样回收率，结果见表1。

2.4.6 样品测定：取样品3批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定甘草酸的含量，每个批号平行测3次，结果见表2。

表2 样品中甘草酸的含量测定结果（n=3）

3 讨 论

3.1 《中国药典》2015年版一部中，HPLC法测定甘草酸含量，主要采用甲醇-醋酸溶液体系、甲醇-醋酸铵体系、甲醇-磷酸盐体系、乙腈-磷酸盐体系、乙腈-磷酸溶液体系、乙腈-醋酸溶液体系[5-9]，文献报道的方法中，流动相用甲醇-醋酸铵（含2%冰醋酸）体系[10]，本文在实验中，考察了上述不同体系，不同比例的流动相，但是甘草酸与相邻峰分离度均达不到药典要求。通过调节流动相的pH值发现，pH值对分离度影响较大，最后甲醇-1%的醋酸溶液（用氨水调pH至4.0）（66∶34）体系，甘草酸峰形好，柱效高，达到良好的分离效果。

3.2 甘草酸的纯品很难得到，而其铵盐容易结晶，易得到纯品，且在酸性流动相体系中，仍以甘草酸形式存在，不影响测定及结果计算[11]，故选择甘草酸铵对照品，用外标法测定。

3.3 本研究显示同一厂家不同批次的甘草锌颗粒，临近保质期的批次甘草酸含量偏低，提示质量控制过程中应考虑保质期设置的安全合理性。

3.4 本文采用的高效液相色谱法，色谱条件简单，分离度符合要求，方法准确，重现性好，样品前处理方便，对甘草锌颗粒的质量控制具有一定的参考价值。

[1] 金芝贵,吴飞华,吴岚,等.甘草锌颗粒治疗复发性口腔溃疡疗效观察[J].上海中医药杂志,2005,39(7):33-34.

[2] 卫生部药品标准·新药转正标准[S].第九册,89-90.

[3] 梁月琴,刘琴棣,吴德政.高效液相色谱法测定甘草及其制剂中甘草酸含量[J].医学研究杂志,1997,26(8):33-35.

[4] 国家药典委员会.中国药典[S].2015年版.一部.北京:中国医药科技出版社,2015:810.

[5] 国家药典委员会.中国药典[S].2015年版.一部.北京:中国医药科技出版社,2015:757.

[6] 国家药典委员会.中国药典[S].2015年版.一部.北京:中国医药科技出版社,2015:565.

[7] 国家药典委员会.中国药典[S].2015年版.一部.北京:中国医药科技出版社,2015:700.

[8] 国家药典委员会.中国药典[S].2015年版.一部.北京:中国医药科技出版社,2015:1142.

[9] 国家药典委员会.中国药典[S].2015年版.一部.北京:中国医药科技出版社,2015:625.

[10] 曹玲,樊夏雷.RP-HPLC法测定甘草锌颗粒中甘草酸的含量[J].药学与临床研究,2007,15(4):292-294.

[11] 孙文基,谢世昌.天然药物成分定量分析[M].北京:中国医药科技出版社,2003:205.