血红素加氧酶1在间歇性低氧大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的影响

王媛媛 曹 建* 万建华

（1 南昌市第三医院心内科，江西 南昌 330009；2 南昌大学第二附属医院麻醉科，江西 南昌 330009；3 景德镇市中医院麻醉科，江西 南昌 330009）

在心肌缺血基础上恢复血流后组织损伤加重，甚至发生不可逆损伤的现象称为心肌缺血再灌注损伤（MIRI）。氧自由基和钙超载是导致再灌注损伤的重要原因，但并不是唯一因素。其他因素还包括有血小板介导的损伤，肾素-血管紧张素系统和补体的激活等[1-3]。如何减轻MIRI，开发研究心肌缺血再灌注的多靶点治疗对于防治缺血性心脏病和临床心脏病介入性治疗的具有重大价值和意义。有研究发现，间歇性暴露于适当低氧环境可激发机体的适应机制，进而产生有利的影响[4]。间歇性低氧适应具有明显的心脏保护作用，可减轻应激、缺血对心肌的损伤。但有关间歇性低氧心肌保护的具体机制研究甚少。本实验拟在研究HO-1在间歇性低氧状态下对心肌缺血再灌注损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂：本实验研究经南昌大学医学院动物伦理委员会审查通过，许可证号为SCXK（赣）2009-0001。取8～10周左右健康清洁级SD大鼠54只，雌雄各半，体质量（200±20）g，由南昌大学动物实验中心提供，所有动物均分笼饲养，标准饮食。全蛋白浓度测定标准品（普利莱公司）；兔抗小鼠HO-1抗体购自Santa Cruz生物科技公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG购自北京中杉生物技术有限公司。

1.2 动物分组及模型建立：将实验动物按体质量随机分为3组：分为假手术组、缺血再灌注组、间歇性低氧-缺血再灌注组。制作间歇性低氧模型[5]，将大鼠暴露在每日4次的低氧循环（每次接受2 min 6%～8%低氧，3 min氧和处理，循环5次），处理14 d，含氧量正常的假手术组作为对照组。假手术组（n=18），丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水；缺血再灌注对照组（n=18），参照赵秀梅垫扎球囊法[6]制作大鼠缺血再灌注模型，间歇性低氧+缺血再灌注组（n=18），建立间歇性低氧动物模型后，再制作缺血再灌注模型。

1.3 大鼠左心室舒张期末容积、左心室收缩期末容积、左心室射血分数测定：所有大鼠在外科处理后8周后进行超声心动图检查。所有测量均由同一观察者行双盲法测量，所有测量结果均连续测3次取平均值。将超声心动图基础参考值由假手术组测得，小鼠用异氟烷（2%in oxygen）行全麻，采用12 MHz探头进行超声心动图检查。二维心室图可从四个腔室和胸骨旁长轴和短轴定位获得。左心室舒张期末容积（LVEDV）和收缩期末容积（LVESV）通过Modified Simpson Rule测量，左心室射血分数（LVEF）=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%。

1.4 Western blot法检测HO-1蛋白表达：制模结束，处死手术处理后的存活大鼠。采用Western blot方法测定HO-1蛋白，提取心肌组织，采用考马斯亮蓝法蛋白质定量。蛋白变性后，将含有20 μg蛋白的样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将凝胶上的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭，用特异性CHOP抗体孵育，4 ℃过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，洗膜后用增强化学发光试剂（ECL）显影液检测底物表达，结果经化学发光凝胶成像分析仪拍照。用Scion Image 4.03软件进行灰度分析，以目的蛋白灰度值与β-actin蛋白灰度值的比值，作为目的蛋白的相对表达率。

1.5 统计学分析：计量资料采用均值±标准差（±s）表示，采用。采用SPSS 17.0软件单因素方差分析（one-way ANOVA）进行组间差异的检验，组间两两比较应用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心室舒张期末容积、左心室收缩期末容积、左心室射血分数：假手术组、缺血再灌注组、间歇性低氧+缺血再灌注组大鼠在外科处理后8周后通过超声心动图测量LVEDV、LVESV、LVEF，与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠左室收缩期末容积、舒张期末积体积增加，左室射血分数下降。间歇性低氧处理后，左室收缩期末容积、舒张期末积体积增加，左室射血分数增加，心功能改善。各实验组LVEDV、LVESV、LVEF与假手术组差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各实验组左心室收缩期末期容积、舒张末期容积、射血分数（±s，n＝18）

表1 各实验组左心室收缩期末期容积、舒张末期容积、射血分数（±s，n＝18）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与I/R组比较，#P＜0.05

组别 LVEDV(μL) LVESV(μL) LVEF(%)假手术组 426±3.2 182±4.1 57±3.9 I/R组 782±1.6* 547±3.5%* 29±1.6*IH+I/R组 518±4.7# 392±2.8# 46±5.3#

2.3 各实验组心肌组织HO-1蛋白表达：通过Western blot法检测各实验组HO-1蛋白水平，与假手术组比较，缺血再灌注组HO-1蛋白蛋白表达降低，两组比较差异有统计学差异（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，间歇性低氧处理后，间歇性低氧-缺血再灌注组HO-1蛋白表达明显增加，两组比较差异有统计学差异（P＜0.05），提示间歇性低氧促进了Nfr2蛋白表达增加。见表2。

表2 各实验组HO-1蛋白表达（±s，n=16）

表2 各实验组HO-1蛋白表达（±s，n=16）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与缺血再灌注组比较，#P＜0.05

组别 只数 HO-1假手术组 18 0.392±3.176缺血再灌注组 18 0.217±1.326*间歇性低氧-缺血再灌注组 18 0.982±4.538#

注：A（假手术组），B（缺血再灌注组），C（间歇性低氧+缺血再灌注组）

3 讨 论

随着医疗技术的发展及溶栓、经皮冠状动脉腔内血管成形术等各种治疗缺血性心脏病方法的广泛开展，MIRI也越来越常见，表现为再灌注后缺血的心肌出现舒缩功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代谢障碍、超微结构的变化及血管无复流等现象[7]。如何防治心肌缺血/再灌注损伤，重新恢复心肌细胞的功能已成为目前心肌保护的研究热点之一。目前有研究表明间歇性低氧适应，类似缺血预适应和长期高原低氧适应，具有明显的心脏保护作用，表现为增强心肌对缺血/再灌注损伤的耐受性、抗细胞凋亡、限制心肌梗死面积和形态学改变及促进缺血/再灌注心脏舒缩功能的恢复[8]，但具体机制目前尚不明确。

在缺血再灌注损伤中，低氧是HO-1的强诱导因素。HO-1作为一种新型的心肌保护因子通过催化血红素降解，其产物的抗炎、抗氧化、抗凋亡和血管舒张等作用在心血管疾病中发挥着重要的保护作用[9-11]。HO-1是血红素氧合酶（HO）的同工酶之一，可被多种刺激因素如：缺血再灌注、热休克、重金属和低氧等诱导表达升高。近年来一些研究结果显示，NO对血红素分子具有亲和力，都能激活鸟苷酸环化酶，调节NO的产生舒张血管的作用。HO-1蛋白能通过催化血红素降解代谢产物，其代谢产物具有的抗凋亡抗炎性反应外。除此之外，在体内和体外均发现HO-1的表达能抑制血管平滑肌细胞的生长，同时发现HO-1作为单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）的下游产物，通过抑制心肌细胞蛋白质的合成，能减轻内皮素及AngⅡ所致的心血管重构。从而达到抑制心肌细胞肥大的作用，并通过抑制心肌肥大，延缓心室重构的提高转录因子NF-E2相关因子蛋白表达，而通过转录因子NF-E2相关因子信号通路调节抗氧化应激，提高谷胱甘肽等抗氧化因子表达.这些研究都明显涉及到对血管损伤后重建的关键[12-14]，在许多疾病中起着重要的保护作用，但相关作用的机制还不完全清楚。

本实验建立间歇性低氧模型及缺血再灌注模型，探讨HO-1在间歇性低氧对心肌缺血再灌注的影响。通过监测各组大鼠心室舒张期末容积、左心室收缩期末容积、左心室射血分数，发现间歇性低氧处理后，左室舒张末期容积及收缩末期容积明显下降，射血分数提高，心功能得到改善。于此同时，通过Western-Blot检测，发现间歇性低氧处理后HO-1蛋白表达升高。表达增高的HO-1蛋白通过抑制心肌肥大及代谢产物抗凋亡抗炎性反应的作用延缓大鼠心肌重构，改善心功能，从而在大鼠心肌缺血再灌注损伤中起到保护作用，其具体机制有待进一步研究。

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