传统方法与分子生物检测方法检测结核病的比较研究

乔相练

结核病是结核分枝杆菌导致，是传染性疾病，在世界范围内具有高发生率和死亡率，对人类健康造成了严重化的威胁。随着防治结核病工作的开展，我国结核病疫情得到有效的控制，发病率下降，但近年来，有些地区的结核病发生出现了回升趋势，引起了学者的高度重视[1]。作为重点防治的传染病，结核病的早期防治主要依靠实验室诊断，发现传染源，确诊结核病，实施治疗。结核病传统的检测方法是痰中结核杆菌检测，做痰涂片和痰培养，但由于周期较长，不能满足临床需要[2]，因此，需要一种新的检测方法。本文选取2016年1月～2017年1月在本院就诊的疑似结核病90例患者，对比分析了传统检测方法和分子生物检测方法，结果如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月～2017年1月在本院就诊的疑似结核病患者90例作为研究对象，男50例，女40例，年龄31～74岁，平均年龄（45.4±3.6）岁，入选患者均对本次研究知情，在参与研究同意书上签字。

1.2 方法 仪器：收集90例患者的痰液标本，使用仪器是美国伯乐CFX96荧光定量PCR检测仪，高倍显微镜。

标本处理：在采集的痰液标本中，加入4%NaOH溶液，剂量是痰液的4倍，然后摇匀，在室温下，静止放置30 min，液化，取1 ml放入离心管中，在离心机中离心5 min，转数是12 000 rpm，去除上清液，沉淀后，加入1 ml无菌生理盐水，打匀，再次放入离心机中离心5 min，转数是12 000 rpm，重复洗涤2次[3]。沉淀后加入50μDNA提取液，充分混合均匀后，提取液体中与水不相溶的物质，提取过程需要使用加样器充分混合均匀后进行[4]。若出现吸管头嘴太细不能吸取或堵塞吸头，要使用未被污染的，将吸管头嘴部减去一段，然后实施金属浴10 min，离心5 min，12 000 rpm。

检测方法：所有标本均使用浓缩集菌涂片抗酸染色显微镜检查，荧光定量PCR检测。方法是取单份PCR反应管，将处理后的保本直接加入其内，8 000 rpm离心5 s，将反应管放入PCR检测仪中，扩增，在93℃下2 min预变性，再93℃45 s，55℃120 s，做30个循环后放入33℃环境中保温，PCR反应后荧光监测，在PCR试管充分的冷却到33℃，迅速将扩增后的反应管放入荧光检测仪中，读取并记录，荧光激发波长是487 mm，检测波长是525 mm。

质量控制：阴性质控品的增长曲线未表现出S型，或者Ct值是空白，阳性质控品的增长曲线表现出S型，且强阳性质控品定量参考值为1×102基因拷贝/ml至2×104基因拷贝/ml。

结果判断：阴性是定量值＜5.000E+02，阳性是定量值＞5.000E+02。

1.3 统计学方法 本研究数据均用SPSS 18.0统计软件处理，计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

传统方法的痰涂片检查诊断阳性56例，阳性率62.2%，分子生物检测方法的荧光定量PCR诊断阳性74例，阳性率82.2%，传统方法的痰涂片检查阳性率低于分子生物检测方法的荧光定量诊断阳性率，两种检测方法存在差异具有统计学意义（χ2=8.792，P=0.002）。且分子生物检测方法的荧光定量PCR与痰涂片阳性符合率为75.6%（56/74），见表1。

表1 传统方法与分子生物检测方法对比Table 1 Comparison of traditional methods and molecular biological detection methods

3 讨论

结核病是结核杆菌引起的慢性传染性疾病，是一种全球性疾病，近年来，结核病的发病率呈现出再次升高的趋势，给全球结核病的防治提出了新的挑战。由于感染结核杆菌后没有明显的症状或体征，仅PPD试验结果为阳性，因此，结核病的诊断成为了临床研究的重点，是结核病防治工作的重点。以往，对于结核病的诊断，主要是根据患者的临床症状和实验室检查结果确诊，但由于一些患者的结核病无明显症状体征，从而给临床诊断带来了一定的难度。实验室对于结核病的诊断主要是根据细菌学涂片和痰培养。痰涂片检查方式不仅能够明确结核病的传染源，而且检查费用低廉，符合我国的国情，但检出阳性率偏低，进而失去了诊断的准确性，但在当前结核病的实验室检查中，痰培养仍是诊断金标准，特别是药敏实验结果，对患者的临床用药和耐药性检测等方面起到了重要作用，不过检测时间加长，因此，需要改进。

随着分子生物学技术的发展，结核病分子流行病学的研究，耐药性的研究新技术的建立，分子生物学技术在结核病研究中广泛的应用，PCR技术已经在结核病实验室诊断中开展应用[5]。PCR技术是利用一对结核分枝杆菌的特异性引物，一条结核分枝杆菌特异性荧光探针，配以PCR反应液，耐热DNA聚合酶，四种核苷酸单体等成分，体外扩增发检测结核分枝杆菌[6-7]。

分子生物检测方法中的荧光定量PCR技术的实施是在PCR反应体系中加入荧光基团，监测荧光信号的累积，监测PCR进程，通过Ct值和标准缺陷测定样品中的DNA进程，1 d内即可得出检验结果[8-9]。由于PCR扩增是在密闭的状态下进行，从而避免了扩增物的污染，减少了假阳性结果的出现，灵敏度和特异性较高[10]。

本次研究中收集了90例疑似患者的痰液标本，对比传统方法和分子生物检测，结果发现传统方法的痰涂片检查诊断阳性率62.2%，分子生物检测方法的荧光定量PCR诊断阳性率82.2%，两种检测方法存在差异具有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，在结核病的检测中，分子生物检测方法简便快捷，灵敏度高，具有较高的诊断和鉴别诊断价值，适合在临床推广应用。

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