血清学筛查联合无创产前检测在胎儿常见非整倍体筛查中的应用

叶强，胡勤，钟强，梁屹，韦懿

伴随着二胎政策的开放，高龄孕妇人数显著增加，研究发现孕妇年龄与胎儿染色体疾病发生率呈正相关[1]。单一的血清学筛查，以其较低的检出率、较高的漏诊率和假阳性率，势必达不到产前筛查的目的[2]。在川南地区，常以血清学筛查联合染色体核型分析进行产前筛查。但是，这种侵入性方法获取胎儿组织（如绒毛活检、羊膜腔穿刺、经腹脐静脉穿刺），会造成0.5%～1%的胎儿流产，同时引起孕妇和家人的焦虑、恐惧等[3]。并且部分介入性产前诊断禁忌证者（先兆流产、发热、有出血倾向、感染未愈等）、怀有珍贵儿的孕妇等拒绝侵入性诊断，进而导致唐氏综合征和爱得华斯（Edwards）综合征患儿的出生，给家庭及社会造成严重的经济压力设精神压力。无创产前检测（NIPT）检测孕妇外周血中胎儿游离DNA（cell free fetal DNA，cff DNA）[4-6]，具有无创伤性、高的检出率和低的假阳性率、适用的孕周范围较大、临床所需信息少，流程较简单，质量控制相对容易等优点[7]。本文旨在研究血清学筛查联合无创产前检测筛查胎儿唐氏综合征和爱得华斯（Edwards）综合征，并对结果进行比较分析。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年9月～2016年9月本院妇产科门诊就诊且自愿进行血清学筛查和NIPT检测的孕妇364例，详细询问并记录孕妇年龄、孕周、末次月经时间、孕产次和既往分娩史。

1.2 方法

1.2.1 血清学筛查 抽取孕妇2 ml静脉血定量检测甲胎蛋白（AFP）和绒毛膜促性腺激素（HCG），结合孕妇的年龄、采血时的准确孕周，应用计算机软件检测胎儿患某些疾病的危险系数。本院T21临界风险为1/1 000≤T21风险值＜1/270，高风险为≥1/270，T18临界风险为1/1 000≤T18风险值＜1/350，高风险为≥1/350。

1.2.2 无创产前检测和数据分析 采取5 ml孕妇外周血于Streck Cell-Free DNA BCT采血管中，采用两步离心法。第一步，在4℃，1 600 g离心15 min，吸去上清血浆，转移至置于冰盒上的2.0 ml离心管，吸掉多余的血浆，吸取白细胞保存。第二步，初步分离的血浆在4℃，16 000 g离心10 min，分装至置于冰盒上的2.0 ml离心管。取400 ml血浆利用磁珠法提取，剩余部分保存于-80℃。将提取的DNA进行文库构建、定量，最后用Bio Seq 4000测序仪进行全基因组测序。

测序结束后，运用《无创产前数据分析管理软件》对测序数据进行分析，得到样本的21号染色体、18号染色体、13号染色体的Z值，根据每个样本的Z值判断样本的检测结果。其核心算法采用通用函数计算Z值，比对、过滤所得到每个样本的唯一匹配reads数即 unique reads数，并计算每个样本每条染色体的unique reads数占该样本所有染色体unique reads数百分比%chrN，即reads ratio值。胎儿染色体非整倍体的阳性判断值及参考区间设置如下：阴性-3≤Z＜1.96，临界（充抽血复查）1.96≤Z≤3，阳性Z＞3。

1.2.3 无创产前检测结果验证 对所有NIPT检测孕妇进行电话随访，记录新生儿出生后有无外貌、结构及智力发育异常等。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清学筛查各年龄组高风险和临界风险发生率 将孕妇按照年龄分为20岁以下、20～24岁、25～29岁、30～34岁、35～39岁、40～44岁、45以上这8个组。35岁以下各组之间和35以上各组之间血清学筛查高风险和临界风险没有显著差异；35岁以上的血清学筛查高风险和临界风险67.65%（23/34）相对于35岁以下36.26%（153/422）有显著性差异（P＜0.05），见表1。即35岁为临界点，35岁以上高龄孕妇发病率急剧上升，见图1。

表1 各年龄组血清学筛查发生率Table 1 Serological screening rates in all age groups

图1 各年龄组血清学筛查发生率Figure1 Serological screening rates in all age groups

2.2 无创检测与血清学检测的比较 各个年龄组血清学筛查的临界风险和高风险的孕妇，进行无创产前检测，结果均为阴性，随访结果新生儿外貌、结构均无明显异常，智力发育良好，见表2。血清学检测为低风险的孕妇，NIPT结果也为阴性（表2中数据未例出）。ROC曲线（receiver operating characteristic curve）表明，NIPT相对于血清学筛查，有更高的准确率，见图2。

3 讨论

不进行产前诊断和治疗性流产的情况下，发达国家DS胎儿的出生率为1‰～2‰，且伴有严重的智力障碍。其中，95%的病例存在21号染色体的不分离，4%易位，1%嵌合[8]。我国是出生缺陷的高发国，目前我国出生缺陷的发生率约在5.6%，每年新增出生缺陷数约90万例。染色体疾病是最为严重的出生缺陷之一。其中，21三体、18三体约占围生期出生缺陷的0.15%，占围生期常染色体非整倍体的95%左右。目前公认最常用、最有效的妊娠早期筛查方案是PAPP-A（血浆蛋白A）、游离β-HCG（人绒毛膜促性腺激素β亚单位）和NT（颈背皮肤透明带厚度联）联合筛查[9]。川南地区，主要采用两联血清学筛查。在本文中，血清学筛查35岁以上高风险、临界风险发生率显著与35岁以下。Eichenlaub-Ritter[10]提出，原因可能是随着年龄增长，卵母细胞老化。Kline[11]提出却是由于延迟受精和精子老化假说。

表2 NIPT与血清学筛查诊断意义的比较Table 2 Comparison of diagnostic significance between NIPT and serological screening

图2 无创与血清学检测结果比较Figure2 Comparison of Non-invasive and serological test results

唐氏综合征和爱得华斯（Edwards）综合征占出生缺陷比例如此之高，且这种胎儿的出生会造成严重的负担，单一的血清学筛查，是不能满足要求的。NIPT T21检出率＞99%、T18、T13检出率约为98%、99%，且假阳性率约为0.13%[12]。本文中，检测结果均为阴性，未发现阳性结果，可能是样本数量在一定程度上还是偏少。虽然NIPT有极高的检出率、低的假阳性率，但在检测染色体平衡易位、嵌合体及环状有困难[13]。NIPT作为一种主要的筛选新方法，孕妇不论其年龄大小，均应知晓筛查风险以及其性质、范围和意义[14-16]。

综上所述，本文中血清学筛查表明，在川南地区，孕妇在35岁以上T21、T18高风险和临界风险率显著增加。NIPT检测结果表明，相对于传统的孕中期血清学筛查相比较，具有高特异性和敏感性，且避免了侵入性检测，更能为孕妇接受。由于无创DNA检测价格偏高，所以建议在川南地区，35岁以下孕妇血清学检测为高危或临界，应该进行无创检测；35岁以上，可以直接进行无创检测。

[1] Donner C,Daelemans C,Ceysens G.Prenatal screening:the example of Dowen,s syndrome screening[J].Rev Med Brux,2015,36(4):207-211.

[2] 边旭明.胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测[J].实用妇产科杂志,2013,29(5):330-333.

[3] 贾蓓,钟梅.高通量测序技术在无创产前检测中的应用[J].中国实用妇科与产科杂志,2015,31(9):807-810.

[4] Lo YM,Corbetta N,Chamberlain PF,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet,1997,350:485-487.

[5] PalomakiGE,KlozaEM,Lambert-MesserlianGM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect down syndrome an international clinical validation study[J].Genet Med,2011,13(11):913-920.

[6] Chiu RW,Akolekar R,Zheng YW,et al.Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing:large scale validity study[J].BMJ,2011,342:c740.

[7] GIL MM,Quezada MS,Revello R,et al.Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta-analysis[J].Ultrasound in Obstetrics and Gynecology,2015,45(3):249-266.

[8] Howard S Cuckle.Primary prevention of Down’s syndrome[J].Int J Med Sci,2005,2(3):93-99.

[9] Nicolaides KH.Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks[J].Prenat Dingn,2011,31(1):7-15.

[10]Eichenlaub-Ritter U.Genetics of oocyte ageing[J].Maturitas,1998,30:143-169.

[11]Kline J,Levin B.Trisomy and age at menopause:predicted associations given a link with rate of oocyte atresia[J].Paediatr Perinat Epidemiol,1992,6(2):225-239.

[12]Anne Flock,Ngoc-Chi Tu,Anna Ruland,et al.Non-invasive prenatal testing(NIPT):Europe’s first multicenter post-market clinical follow-up study validating the quality in clinical routine[J].Arch Gynecol Obstet,2017(2):1-6.

[13]李燕芳,张兰珍,田耕,等.胎儿游离DNA用于无创产前检测21、18、13三体综合征的临床研究[J].中国妇产科临床杂志,2015,16(2):126-129.

[14]Benn P,Borrell A,Chiu RW,et al.Position statement fromthe Chromosome Abnormality Screening Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis[J]. Prenat Diagn,2015,35:725-734.

[15]Schmid M,Klaritsch P,Arzt W,et al.Cell-Free DNA testing for fetal chromosomal anomalies in clinical practice:Austrian-German-Swiss recommendations for non-invasive prenatal tests(NIPT)[J].Ultraschall Med,2015,36:507-510.

[16]Kagan KO,Sonek J,Wagner P,et al.Principles of first trimester screening in the age of non-invasive prenatal diag-nosis:screening for chromosomal abnormalities[J].Arch Gynecol Obstet,2017,296(4):635-643.