液相芯片技术检测耐多药结核分枝杆菌的方法分析

张国斌

（沈阳市疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110031）

本实验对液相芯片技术在检测耐药结核分歧杆菌方式的可行性加以研究，利用对内含rpoB526和rpoB531以及katG315的耐药突变性基因位点，对直立浓度稀释情况进行模拟，分析此法在检测多药结核分歧杆菌最低浓度，结合最佳反应体系，监测重组质粒，分析相关方式的稳定性和特异性。

1 资料与方法

1.1 仪器与材料：选择含有atG315、rpoB526和rpoB531的耐药突变基因位点模拟性质粒为实验材料。实验设备为悬浮芯片系统（200液相），离心机，96孔板离心机，梯度PCR设备，核酸电泳设备，凝胶成像体系，微孔恒温震荡设备，压力式蒸汽灭菌设备，恒温摇床，pH计，涡旋震荡设备。移液器。

设备类型为：荧光微球，DNA聚合酶，鞘液，dATP，Biotin-14-dCTP，dGTP，ExoSAP-IT PCR引物以及ASPE引物。实验室内配制：氨苄青霉素、LB液培养基、LB固体培养基、50*TEA缓冲液、2*杂交缓冲液、1*杂交缓冲液。

1.2 方法

1.2.1 灵敏度实验：对于移液器、无菌操作台和枪头实施紫外线灭菌，照射时间为20 min，后在实验前使用浓度为75%的乙醇擦拭操作台和双手。

使用移液器，在吸取剂量为5 μL内含katG315、rpoB526和rpoB531突变基因位点的菌种，将其加入到5 mL含有Amp抗性LB液体培养基内，在37 ℃环境下，220 rpm摇床内过夜培养。完成质粒提取后，将重组质粒浓度稀释到150 ng/μL，后稀释浓度，设定阴性对照。稀释后质粒进行PCR扩增和纯化，在此同时完成荧光微球杂交、ASPE检测样本，上述质粒每个浓度取3个平行样本。将获取后样本利用设备进行检测，获得最低浓度。

1.2.2 重复实验：结合8个浓度相同的重组质粒，结合最佳反应条件，相隔2 d实施PCR扩增和纯化、荧光微球以及ASPE反应1次。将获取的样本使用平行仪器加以检测，共计5次。每次检验时，择取3个平行样本，后结合样本，计算出MFI值，视为每次检测的最终结果，后将每个质粒的多次检验结果进行统计学分析，算出SD值以及变异系数（CV）。

2 结 果

2.1 灵敏度检查：结合每种质粒平行样本检测结果，算出MFI值和SD值，所检测出的荧光信号随着质粒浓度的变化而变化。表1显示出8类重组质粒检测的最低浓度，结果提示，此法能够检测出最低的质粒浓度为1 ng/mL，灵敏度较高。

表1 8类质粒最低间检出浓度情况

2.2 重复性实验：在最佳反应条件下，相隔2 d对8种质粒实施检测，结果证实5次检测可判断出katG315、rpoB526以及rpoB531位点基因型，结合相关结果，计算SD值和荧光值。阴性对照的MFI为（37±9.95），质粒样本变异系数为6.73%～13.75%，证实此法稳定性强。

3 讨 论

本实验分析了液相芯片技术检测耐多药结核分枝杆菌方法灵敏性、重复性和特异性加以验证，结果证实，此法能够检测出最低的质粒浓度为1 ng/mL，灵敏度较高。5次检测可判断出katG315、rpoB526以及rpoB531位点基因型，结合相关结果，计算SD值和荧光值。阴性对照的MFI为（37±9.95），质粒样本变异系数为6.73%-13.75%，证实此法稳定性强。

值得说明的是，有文献指出[1]，液相芯片技术检测耐多药结核分枝杆菌方法可以精确的检测出质粒内单位点以及多位点，且检测点之间无信号干扰[2]，每个ASPE引物只能在该检测点基因型加以检测，特异性高，另外，该项技术中的荧光微球种类多达100余个，这在一定程度上确保了高通量检测。在实施检查过程中，仅需要结合检测序列信息所使用荧光微球中的相关信息，就能够设计出不同的ASPE引物。就能够完成耐药结核分歧杆菌多位点检测[3]。

值得说明的是，这项技术在操作上相当简便，1位实验者在8 h内就能够完成上百个突变位点检查，在一定程度上节省了检测时长。既往药敏测试法、序列测试法等检测周期较高，工作量大，无法在同一个时间内完成多样品操作。与之相较而言，液相芯片法在一定程度上节省了人力和时间，可在较短操作周期内完成多样本操作[4]，节省人力和工作时长，短时间内取得检测结果，方便医师制定治疗方案，令患者可及时接受治疗。除了可令病患及时得到治疗，延缓疾病恶化外，还能够减少耐多药结核病传播和发展，进而控制病情，减少患者发生耐多药结核风险。

就检测成本角度来看，利用液相芯片技术对耐多药结核杆菌进行分离时，每个检测样本的成本仅为80元，如果需要额外增加新的位点，仅仅需要增加与之对应的引物以及荧光微球，后者成本为3元人民币。虽说Xpert试剂盒可在短时间内取得检测结果，但其成本较高[5]。既往金标准测序法需要大量克隆检测片，只有这样，才能够确保检验结果的精准性，检测单个样本的成本大约为620元人民币。

由此能够看出，使用液相芯片技术检测多药结核分歧杆菌价格低廉，适合发展中国家开展，由此可见，此法在检耐多药结核分歧杆菌上，具有更高的应用价值。

4 小 结

本次实验全面结合了液相芯片技术和等位基因引物延伸反应，创建了检测耐多药结核分歧杆菌的新方式。翻阅近几年文献可知。结核分歧杆菌耐药和基因突变存在相关性，katG315、rpoB526和rpoB531基因位点为常见突变点，在此其中katG315会引起结核杆菌对异烟肼耐药，而其他两种基因点会对利福平耐药。基于此，本实验利用液相芯片技术对以上耐药基因位点进行检测。

经证实，该项技术在检测结核分支杆菌的灵敏性、重复性较好，可靠性高，能够精准的检测出各个基因位点突变情况，值得说明的是，液相芯片技术经济性强，操作简单，快速，值得进一步在临床中推广使用。

[1] 芮冬妹,朱珍,樊燕,等.基因芯片技术检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的结果分析及临床价值[J].广西医学,2017,39(1):98-99.

[2] 吴国兰,陈晓红,翁丽珍,等.基因芯片技术在鉴定分枝杆菌属及早期诊断耐药结核中的价值分析[J].中国医刊,2016,51(5):44-47.

[3] 赵永,梁庆福,林淑芳,等.Xpert MTB/RIF检测技术用于耐多药结核分枝杆菌利福平耐药检测分析[J].中国卫生检验杂志,2015(15):2621-2622.

[4] 杨慧娟,马利,陈连勇,等.Xpert MTB/RIF技术对结核分枝杆菌检测和耐多药结核快速筛查的研究[J].中国卫生检验杂志,2015(23):4056-4059.

[5] 舒丽红,丁显平.基因芯片方法检测耐异烟肼结核分枝杆菌准确性的Meta分析[J].检验医学与临床,2016,13(15):2121-2125.