费休氏容量法测量冻干人用狂犬病疫苗中水分含量的不确定度分析

邱文娜 饶 玲 王永智 方朝东 李 磊

江苏省泰州医药高新技术产业园区疫苗工程中心，江苏泰州 225300

狂犬病是由狂犬病毒所致的人畜共患急性传染病，流行性广，病死率100%，有效预防该病的措施是接种狂犬病疫苗[1]。目前，上市的狂犬疫苗有两种剂型，冻干粉针剂因技术含量高、易于保存、免疫反应轻等特点，将逐步成为市场主流。水分含量是冻干粉针剂疫苗稳定性相关的一个重要参数，在日常质检过程中诸多因素会影响该检测结果的准确性[2-6]。

本实验室该项检测项目于2012年获得CNAS认可，曾两次参加CNAS组织的测量审核、能力验证，且结果均为满意。本文利用瑞士万通870型水分测定仪测定冻干人用狂犬病疫苗中的水分含量，根据日常检测经验对影响测定结果的四大因素进行不确定度评定，该因素包括测量重复性、卡尔费休试液滴定度、卡尔费休试液滴定体积、称样量[7-10]。依据不确定评定方法，建立不确定度分析的数学模型， 逐步考察各不确定度分量，找出分析过程中的关键点，为日常检测数据的准确性和可靠性提供依据[11-15]。

1 材料与方法

1.1 样品

冻干人用狂犬病疫苗，由中心内疫苗研发企业提供。

1.2 主要试剂及仪器

无水甲醇（分析纯，含水量＜0.1%）；卡尔费休试剂（批号 SZBD0490V，Sigma Fluka）；标定用水；电子天平（Sartorius BSA224S-CW）；卡尔-费休水分测定仪（瑞士万通KF 870型）；微量注射器、药匙。凡与样品或费休氏试液直接接触的物品，如称量勺、玻璃器皿、橡皮塞均应在80℃干烤2h，取出置干燥器内冷却20min备用。

1.3 环境要求

环境湿度对检测结果影响较大，且卡尔费休试液具有吸水性，因此水分检测实验室湿度需低于50%，仪器干燥用分子筛需状态良好，与样品直接接触的称量纸、称量勺、捣碎工具均需80℃干燥。

1.4 检测方法

1.4.1 滴定杯微环境的平衡 加入50mL无水甲醇至滴定杯中，启动仪器平衡模式，消除滴定杯中存在多余水分干扰，等待仪器显示conditioning ok，即漂移值小于20µL/S时，即可开始标定。

1.4.2 卡尔费休溶液的标定 选择Titer标定模式，使用尖头微量注射器吸取约20mL标定用水，注意排除气泡，精密称定注射器和水样质量并做好记录，选择仪器进样键，快速加入水样至滴定杯中，再次精密称定注射器质量，两次质量之差即加入的标定用水质量，将进样量输入仪器，按start键开始滴定，滴定结束后，仪器自动显示本次标定消耗卡尔费休试液体积、滴定度F值，如此连续测定3次，3次连续标定结果相对标准偏差在±1%以内，以平均值作为卡尔费休试液的滴定度。

1.4.3 供试品的测定 选择KFT测定模式，天平去皮，精密称定供试品90～100mg置干燥的称量纸中，记录进样前质量，选择仪器进样键，快速加入供试品至滴定杯中，精密称定称量纸质量，两次质量之差即加入的供试品质量，将进样量输入仪器，按start键开始滴定，滴定结束后，仪器自动显示本次标定消耗卡尔费休试液体积、供试品含水量。

2 不确定度分析

2.1 数学模型和不确定度来源分析

依据中国药典2015版通则0832卡尔费休容量法测定原理及万通水分测定仪测定流程，供试品含水量公式为：

其中V1为称取的供试品消耗的费休氏试液的体积，mL；W1为供试品进样量，mg；F为卡尔费休试液标定F值的平均值，mg/mL；W为标定中消耗的标定用水的质量，mg；V为标定中标定用水消耗的费休氏试液的体积，mL。

根据公式（1）可知，卡尔费休容量法检测供试品含水量的不确定度主要来自：（1）测量重复性；（2）供试品进样量；（3）供试品消耗的卡尔费休试液体积；（4）卡尔费休试液滴定度F值。本实验在标定及检测开始前均有平衡过程，漂移值保持在20µL/s以内，消除了溶剂中水分的影响，所以本文忽略考察无水甲醇溶剂中水分带来的不确定度。实验采用的水分测定仪可自动判断滴定终点，消除人为影响，操作全过程环境湿度低于50%，与供试品接触直接接触实验材料均经过80℃干燥，且密闭的滴定杯连接有分子筛干燥剂，因此忽略考虑由终点判断和环境水分引起的不确定度。

2.2 各分量标准不确定的评估

2.2.1 测量重复性标准不确定度分量Urel（x）

称取同一批次样品3份，测定含水量，结果如下：2.54%，2.59%，2.57%；平均值为2.57%。

根据贝塞尔公式实验标准偏差为：

结果平均值的相对标准不确定度为：

2.2.2 称取的供试品质量W1引入的相对标准不确定度Urel（W1） 供试品称量不确定度来自天平称量重复性和天平校准两个方面。本实验所用电子天平精度为d=0.01mg，天平检定证书列出的重复性误差为±0.05 mg，属 B 类不确定度，按矩形分布（包含因子），天平称量重复性的不确定度为天平校准产生的不确定度，所用电子天平（d=0.01mg）的检定证书给出的最大允差为±0.03 mg，属 B 类不确定度，按矩形分布（包含因子），天平校准产生的不确定度为：

因此，单次称量的标准不确定度为，样品称量带来的相对不确定度为（样品称样量为95.4mg，

2.2.3 供试品消耗的费休氏试液的体积V1引入的相对标准不确定度Urel（V1）

该不确定度分量主要来源于滴定管校准和实验室温度波动两个方面，滴定管校准引入的标准不确定度U1（V1），根据水分测定仪技术报告得知10mL滴定管的最大允差为0.02mL，按三角分布，标准不确定度实验室温度变动引入的标准不确定度U2（V1），根据仪器资料，10mL滴定管校准温度为20℃，而本实验室温度在25℃，实验室温度变化近似为矩形分布，属于B类不确定度。本实验所用卡尔费休试剂膨胀系数为1.2×10-3/℃，V1均值为0.6044mL（0.6103，0.6280，0.5750），标 准 不 确 定 度 U2（V1）=0.6044×5×1.2×10-3/= 2.09×10-3mL，将U2（V1）两个分量进行合成，得到相对标准不确定度

2.2.4 标定结果F值引入的相对标准不确定度

卡尔费休试液滴定度F值引入的不确定度由标定用水质量、标定时消耗的卡尔费休试液体积、标定操作重复性、标定用水纯度构成，因本实验所用标定用水缺少证书，所以该项不确定度分量不予考虑。

标定用水质量引入的不确定度U1（m1），因与供试品称量共同同一台天平，由2.2.2可知单次称量的标准不确定度为：u（mi）=0.0337，标定用水称量带来的相对不确定度为（标定用水称样量mi为19.9mg，mi为 19.8、19.9、20.1）：

标定时消耗的卡尔费休试液体积引入的相 对 标 准 不 确 定 度 U2（V标），由 2.2.3可 知，U（V标1）=0.02/=0.00816mL，V 标 均 值为 4.9222mL（4.9114，4.9070，4.9481）U（V标2）=4.9222×5×1.2×10-3/= 1.705×10-2mL，将 U2（V标1）、U2（V标2）两个分量进行合成，得到相对标准不确定度

标定操作重复性引入的相对标准不确定度U3（x），通过平行试验3次，测得F值分别为4.0314，4.0554，4.0622，由2.2.1贝塞尔公式可知其标准偏差为0.01618，平均值为4.0497，相对标准不确定度U3（x）为 0.00400。

将 U2（m1）、U2（V标）、U3（x）进行合成，F 值的相对标准不确定度

2.2.5 合成标准不确定度的计算

表1 各分量的不确定度评估表

以相对标准不确定度的平方和进行合成，得到合成标准不确定度

2.2.6 扩展不确定度的计算

取包含因子K=2，置信概率为95%，水分测定结果的扩展不确定度为：U（x）=K×Uc（X）=2×0.041%=0.082%。

2.2.7 报告不确定度

本实验室按照现行药典标准测定冻干人用狂犬病疫苗含水量，取包含因子K=2，置信概率为95%，检测结果可表示为含水量X=2.57%±0.082%。

3 讨论

本实验中，卡尔费休水分测定法不确定度来源主要涉及测量重复性、供试品质量、卡尔费休试液消耗体积及标定F值，其中供试品消耗的卡尔费休试液体积引入的相对标准不确定度为0.0139，所占比例最大，其次为标定结果F值和测量重复性引入的不确定度，影响标定结果F值的各不确定度分量中，标定时的卡尔费休试液体积和标定重复性引入的不确定度相当，且远大于标定用水质量引入的不确定度，标定重复性和测量重复性引入的不确定度属于A类不确定度，描述了各个测量值的分散度，因本实验室在长期日常检测中标定和测量重复性较好，所以观测次数n取了三次，当重复性较差时，n应相应增大，以客观计算该项不确定度值。由于本实验采用减量法称重，两次称量的校准偏差相互抵消，所以样品称量引入的不确定度最小，可以忽略不计。

由表1中各不确定度分量评估可知，使用费休氏容量法测量冻干人用狂犬病疫苗中水分含量时，需根据样品性质选用滴定度稳定的卡尔费休试剂，并严格控制水分检测实验室的温湿度环境条件（湿度控制在50%以内），每月更换水分测定仪干燥用分子筛，控制平衡时间在5min以内，平衡时间过长时需注意考虑卡尔费休试液稳定性、无水甲醇是否新换及滴定杯内微环境等因素，逐一排查。标定时控制连续三次测定的F值相对标准偏差在±1%以内，以最大降低由卡尔费休试液体积、F值带来的不确定度。样品称量引入的不确定度虽然最小，但当进样方式不正确时，质量比较轻的冻干粉类样品会飘溅到滴定杯壁上，本实验室经多次实验总结应选用质地较硬的硫酸纸进行称量，并将硫酸纸剪成合适的形状，以减少进样时的样品损失。检测实验室内应设置烘箱，凡与样品直接接触的称量勺、烧杯，都应进行80℃长时间烘干，并做到取样快， 称量快，转移快， 尽量使样品暴露在空气中的时间最短，以降低系统漂移。当两次检测间隔时间过长时，需更换滴定杯中溶剂无水甲醇，以降低反应微环境中水分的影响。

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