肝苏颗粒对胆总管阻塞性肝纤维化大鼠肝功能和病理损伤的影响

谢君，谢晓芳，李梦婷，唐欣，熊秋韵，彭成

胆总管结扎手术是制备阻塞性肝纤维化动物模型的方法[1]。肝苏颗粒是由赶黄草制成的单味中成药制剂，有研究表明赶黄草提取物可减轻胆汁淤积性肝纤维化[2]，本课题组前期发现肝苏颗粒对CCL4导致的化学损伤性肝纤维化有治疗作用[3]，现为探寻肝苏颗粒对胆总管结扎致阻塞性肝纤维化疾病的预防及治疗作用，为肝苏颗粒的进一步临床应用提供药理理论依据，故本实验通过结扎大鼠胆总管建立阻塞性肝纤维化模型，观察肝苏颗粒对实验性肝纤维化的防治作用及探讨初步作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

SD大鼠，体重180～220 g，雄性，SPF级，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(川)2013-19。已通过实验动物伦理委员会批准使用。

1.2 药物与试剂

受试药物：肝苏颗粒浸膏，提供单位：四川古蔺肝苏药业有限公司，5 g原生药/mL，实验前用蒸馏水分别配制成1.67 g·mL-1备用；秋水仙碱片，由云南植物药业有限公司生产，批号20141103，使用前用生理盐水配成0.01 mg·mL-1备用；水合氯醛，由成都市科龙化工试剂厂提供，批号20111123；ALT、AST试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司，批号分别为150681、150611；TBIL、ALP、ALB、TP试剂盒均由四川迈克生物科技股份有限公司提供，批号1115121、0315071、1215061、1115031。

1.3 主要仪器

全自动生化分析仪（美国BECKMAN COULTER公司，型号AU5400）；低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号TDZ5-WS）；多功能酶标仪（美国Thermo公司，VARIOSKAN FLASH）。电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司，型号JA1003。

2 方法

2.1 造模及给药

通过文献报道[1]及预试验确定造模方法。取成年SPF级别SD雄性大，64只大鼠，待适应环境后，按体重随机分为4组，即假手术组、模型对照组、秋水仙碱组和肝苏颗粒组，每组15只，禁食不禁水12 h后进行胆管结扎手术，具体方法：以10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射麻醉，仰卧位固定，去腹部被毛后用碘伏、酒精消毒皮肤，在剑突下约2 cm处沿腹正中线切开皮肤约3 cm，逐层打开腹腔，在十二指肠和胃大弯处的大网膜内找到胆总管，小心游离一段，将一钝性针置于胆总管下，双线结扎胆总管，然后逐层缝合腹膜、肌层和皮肤。假手术组暴露胆总管后即关腹，不行结扎。术后注射青霉素20万U/只抗感染。实验过程中室内温度维持在25 ℃左右。于术后第2天开始灌胃给药，假手术组和模型对照组给予生理盐水10 mL/（kg·d）-1，肝苏颗粒组灌胃药液16.7 g·kg-1，秋水仙碱组灌胃秋水仙碱0.1 mg·kg-1。每日1次。当肝组织出现明显肝纤维化表现时终止试验，总时间不超过8周。

2.2 指标检测及方法

末次给药后，禁食不禁水12 h，然后以10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射麻醉，各组动物股动脉取血，约取3 mL于未加抗凝剂的采血管中。取血后，处死各组大鼠，每只大鼠剖取肝、脾、胸腺，称湿重，计算脏器系数（脏器系数=脏器湿重/体重×100%），取血离心后取血清采用全自动生化仪测定ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和ALB水平，在同一肝叶位置切取小块肝组织置入10%甲醛缓冲液固定，HE染色和Masson染色行病理组织学检查。

2.3 统计学方法

所有数据均使用SPSS22.0软件包建立数据库，计量资料以均数±标准差形式（ x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。

3 结果

3.1 一般情况

除假手术组外，胆总管结扎大鼠于手术后1周内开始出现黄疸，表现为眼睛、耳朵、皮毛黄染，尿液颜色呈浓茶色。2周后，各给药组黄疸症状减轻，活动和进食情况均较模型对照组好。解剖时发现模型对照组大鼠胆管结扎胆管管径增粗，肝肿大，或区域变硬，点状坏死；给药组大鼠上述病变相对模型对照组轻。从体重看，自第2周起，模型对照组大鼠体重明显低于假手术组（P＜0.05或P＜0.01），而第4周起秋水仙碱组和肝苏颗粒组大鼠体重均明显高于模型对照组（P＜0.05或P＜0.01）。结果见下表1。

表1 肝苏颗粒对胆管阻塞性肝纤维化大鼠体重的影响(x±s)

3.2 对胆管阻塞性肝纤维化大鼠肝功能的影响

根据模型对照组大鼠肝功能的变化在第8周末结束试验。与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和球蛋白水平明显升高，ALB含量及白球比值均明显下降（P＜0.05或P＜0.01）；与模型对照组比较，秋水仙碱组和肝苏颗粒组各给药组血清ALT、AST、TBIL、ALP、DBIL及球蛋白含量均明显下降（P＜0.05或P＜0.01），ALB含量及白球比值有增加。结果见下表2。

表2 肝苏颗粒对胆总管结扎致肝纤维化大鼠肝功能的影响(x±s)

3.3 对胆管阻塞性肝纤维化大鼠肝，脾和胸腺脏器系数的影响

结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠的肝脏系数均显著升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，阳性药物组及肝苏颗粒组可明显降低肝脏系数，同时阳性药物组可降低脾脏系数，肝苏颗粒及秋水仙碱组对胸腺系数无明显作用。结果见表3。

表3 肝苏颗粒对胆总管结扎致肝纤维化大鼠脏器系数的影响(x±s)

3.4 对胆管阻塞性肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响

HE染色结果显微镜下见假手术组肝脏形态结构正常，间质未见结缔组织增生，无肝纤维化表现；模型对照组肝脏可见胆管上皮细胞增生，炎症细胞浸润，可见少量肝细胞坏死灶和大量脂肪空泡，胆管上皮周围胶原纤维沉积，形成纤维间隔，分隔改建原有肝小叶，出现轻至中度的纤维化，秋水仙碱组及肝苏颗粒组肝脏纤维化程度与模型对照组比较病变有所减轻。结果见下图1。

Masson染色发现，正常对照组大鼠肝小叶结构清晰，细胞排列整齐，仅中央静脉及汇管区血管壁着蓝色，周围有少量胶原纤维。模型对照组大鼠肝组织可见明显的胆汁淤积，汇管区明显着色，胶原纤维大量增生，纤维间隔增多增宽，并向肝小叶内延伸，交联呈网状结构，形成完整的纤维间隔，分隔改建后形成假小叶。秋水仙碱组大鼠肝汇管区增生纤维较模型对照组纤细菲薄，细胞少见肿胀和坏死，未见完整假小叶形成，肝窦周围少量着色。肝苏颗粒组大鼠肝组织仅见少量残留的胶原纤维痕迹和胆汁淤积，病变分布小灶性，病变均明显轻于模型对照组。见图2。

图2 肝苏颗粒对胆总管结扎致肝纤维化大鼠肝组形态学的影响（Masson染色，100×；A．假手术组；B．模型对照组；C．秋水仙碱组；D．肝苏颗粒组）

与正常对照组比较，模型对照组评分明显升高，差异有显著性意义(P＜0.01)。与模型对照组比较，各给药组评分都降低，秋水仙碱组及肝苏颗粒组可显著降低肝纤维化评分（P＜0.05或P＜0.01）。结果见下表4。

表4 肝苏颗粒对胆总管结扎致肝纤维化大鼠肝脏纤维化变的影响(x±s)

4 讨论

胆总管结扎致阻塞性肝纤维化模型与临床上因胆汁分泌障碍，胆道阻塞所引起的肝纤维化病程相似[4]，因此该模型可以应用在抗肝纤维化药物筛选方面。通常将血清ALT与AST作为评判肝损伤程度的重要指标[5]，同时有研究表明AST水平与肝纤维化进展有相关性-[7]。TBIL和DBIL可作为胆汁淤积型肝损伤的检查指标[8]。当胆汁排泄受阻时，血清ALP常与血清胆红素相平行呈明显升高趋势[9]。ALB水平可以反映肝脏合成代谢和储备功能，可以作为评估肝纤维化严重程度及判断预后的指标[4]。

本实验通过血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP等来判断肝损伤的程度，再结合HE染色、Masson染色从不同的角度来反映肝苏颗粒对肝纤维化的作用。从本研究结果来看，与假手术组比较，模型对照组大鼠血中ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平显著升高，ALB水平明显降低，差异具有显著性（P＜0.01或P＜0.05），提示该模型大鼠的胆道梗阻明显，肝细胞功能受到损伤。与模型对照组比较，肝苏颗粒组大鼠血清ALB有所升高，其余指标均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），表明肝苏颗粒能降低胆总管结扎致肝纤维化大鼠肝损伤程度，降低胆红素的作用。HE染色和Masson染色病理结果显示，肝苏颗粒可降低肝脏内炎症反应和纤维化程度。

综上所述，肝苏颗粒能明显改善胆总管结扎致肝纤维化大鼠的肝功能和肝组织病理损伤，具有显著疗效。而本药的治疗机制和量效关系有待进一步研究。

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