三黄泻心汤对Ⅱ型糖尿病大鼠的降血糖作用研究

刘巧，胡慧玲，岳青，方明，王战国

图1 糖尿病（消渴）的中医治疗模式图 [10]

三黄泻心汤始载于张仲景的《金匮要略》，由大黄、黄连、黄芩三味中药组成[1]，在治疗中医消渴证（糖尿病）的临床应用中疗效明确，同时以其为基础衍生的类方也广泛用于消渴证（糖尿病）的临床治疗[2～3]。中华中医药学会2007年发布的《糖尿病中医防治指南》总结出糖尿病（消渴证）的中医治疗模式图中，泻心汤及类方具有重要贡献[4]（见图1）。研究证实三黄泻心汤及所含中药大黄、黄连、黄芩中化学成分均具有明确的抗 Ⅱ 型糖尿病的生物活性[5～9]。流行病学调查结果显示糖尿病发病率日益提高，中国已成为世界糖尿病第一大国，成年人口发病率达11.6 %，糖尿病前期患者更是高达50.1%[11]。因此，本课题以三黄泻心汤为研究对象，初步开展其对实验性糖尿病大鼠的降血糖研究，以对后期的机制研究和临床用药进行指导。

1 实验材料与仪器

1.1 实验动物

SPF 级 SD 雄性大鼠 40 只，体重 90±10 g，购买自成都达硕生物科技有限公司，科技部实验动物生产许可证编号： SCXK（川） 2011-20。

1.2 实验仪器

HEM-112 欧姆龙血糖仪（欧姆龙自动化（中国）有限公司）；二型糖尿病大鼠造模实验21BS-101 血糖试纸（欧姆龙自动化（中国）有限公司）；CX2000 动物秤（500 g ± 0.01 g）（CHANGXIE/长协电子有限公司）；YB-ZBJ-X40制冰机（上海亿倍实业有限公司）；FA1004B 电子分析天平（上海平轩科学仪器有限公司）；DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.3 试剂耗材

葡萄糖（成都市科龙化工试剂厂）；高脂高糖饲料[维持饲料65%，猪油10%，蔗糖20%，胆固醇2.5%，胆酸钠1%，混调剂（鸡蛋麻油花生）1.5%（北京博爱港商贸有限公司）；链脲佐菌素（STZ）（北京博爱港商贸有限公司，批号：170226，纯度≥98.5 %）；柠檬酸和柠檬酸钠（北京博爱港商贸有限公司）；大黄药材（四川省中药饮片有限责任公司，批号：161010），黄连药材（四川省中药饮片有限责任公司，批号：170330），黄芩药材（四川省中药饮片有限责任公司，批号：160827），经鉴定，药材各项指标均符合《中华人民共和国药典》2015 版规定项下要求；盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药公司，批号：AA07507，规格：0.85 g/片）。

2 试验方法

2.1 样品溶液的制备

2.1.1 三黄泻心汤合煎液的制备 取大黄粉末120 g、黄连粉末60 g、黄芩粉末60 g（均过四号筛），精密称定，以上三味，加入10倍量纯水浸泡30 min后煎煮三次，第一次1.5 h，第二次1 h，第三次40 min，合并煎液，趁热滤过，得煎煮液约800 mL。然后将400 mL煎煮液浓缩至200 mL后冷冻干燥得粉末54 g，计算粉末得率为22.5 %。临用前用生理盐水配置成浓度为56.25 mg粉末/mL的灌胃溶液（临床剂量换算为1.5 g生药/kg，每只给药体积为2 mL），置于4 ℃冰箱保存备用。

2.1.2 盐酸二甲双胍溶液的制备 取盐酸二甲双胍片10片，加入243 mL 纯水稀释成35 mg·mL-1的灌胃溶液（临床剂量换算为210 mg·kg-1，每只给药体积为2 mL），置于4 ℃冰箱保存备用。

2.1.3 缓冲液的制备 取柠檬酸(FW:210.14) 2.1 g ，精密称定，加入双蒸水 100 mL 中配成 A 液；取柠檬酸钠(FW:294.10) 2.94 g，精密称定， 加入双蒸水 100 mL 中配成 B 液；用时将 A、B 液按一定比例混合（1：1.32），pH 计测定 pH 值,调节 pH =4.2～4.5，即是所需配置 STZ 的柠檬酸缓冲液。制备完成后抽滤，置于4 ℃ 冰箱保存备用。

2.1.4 40%葡萄糖溶液的制备 取葡萄糖40 g ，精密称定，加入生理盐水100 mL 配制成40 %葡萄糖，置于4 ℃ 冰箱保存备用。

2.2 实验设计

2.2.1 动物分组与饲养方法 实验前适应饲养一周，给予标准光照周期（14 h 光照、10 h 黑夜），实验室温度维持在20～25 ℃，相对湿度控制在70 %左右。将大鼠随机分为 4 组，每组 10 只，对其中3 组大鼠喂食高脂高糖饲料，另一组喂食普通饲料，不限制进食量，自由饮水。每周对大鼠进行进食量、饮水量和体重等基础数据的测定。

2.2.2 STZ造模 对大鼠喂食高脂高糖饲料 1～2 月，诱导其产生胰岛素抵抗，然后进行 STZ 注射。SD 大鼠隔夜禁食 12 h，不禁水，精密称取大鼠体重，按照50 mg·kg-1给药剂量设计药物浓度及给药体积。称取 STZ 溶于配好的柠檬酸缓冲液中，涡旋至充分溶解，置于冰浴中，在 20 min 内快速完成大鼠腹腔注射。在造模后 2 h 可以正常喂食。

2.2.3 Ⅱ型糖尿病大鼠模型验证 造模一月内，每周大鼠白天禁食 6 h，取尾部血液少许，使用欧姆龙血糖测试仪及欧姆龙血糖试纸进行血糖检测，检测大鼠空腹血糖（FBG），采用 FBG≥16.7 mmoL·L-1为判定标准，若大鼠血糖值高于标准，则初步判定糖尿病大鼠高血糖模型造模成功。

葡萄糖耐受试验（OGTT）：实验大鼠隔夜禁食12 h 以上，腹腔注射 2 g·kg-1的 40%的葡萄糖溶液，在 0、30、 60 、90 和 120 min 的时候采集尾静脉血，测量并记录其血糖值，然后计算相应的曲线下面积（AUC）。

2.2.4 给药方法和分组 将模型成功的糖尿病大鼠24 只，随机分为三黄泻心汤组（XXD）、二甲双胍阳性药组（MH）、模型组（DM）3 组，“2.3.1”项下喂食普通饲料的大鼠设为正常组（NC），每组8只。每组分别给予相应药物 2 mL/只/d，正常组和模型组给予等量的生理盐水。于给药后每周测量大鼠体重，饮水量，进食量等，于给药每两周测量大鼠空腹血糖（FBG），于给药每四周测定大鼠口服葡萄糖耐量（OGTT）。

2.3 统计学处理

采用 SPSS 21.0 统计软件进行统计分析，实验数据均以( ±s)表示，组间比较用t 检验，P＜0.05 为数据统计有统计学意义。

3 试验结果

3.1 Ⅱ型糖尿病大鼠模型验证

造模一月后，与正常大鼠相比，造模后的大鼠体重增幅较小，甚至有所下降，血糖值均高于FBG≥16.7 mmol·L-1，尿量明显增加，饮水量和进食量明显高于正常组。此结果符合糖尿病大鼠“三多一少”的特点，初步判定二型糖尿病造模成功。由图1可知实验糖尿病大鼠在 2 h 内对葡萄糖表现出耐受，表明二型糖尿病造模成功，可进行下一步的实验。

图1 三黄泻心汤给药前对糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影响

3.2 体重

实验组大鼠从购入到治疗结束共计18 w，本实验记录了18 w大鼠的体重变化（表1）。由表1 可以看出，造模前 SD 大鼠的体重始终呈现增加趋势，造模后其趋势放缓，并在造模后(7～10 w)体重出现降低。给药 8 w 后（即11～16 w），NC组大鼠体重平均增加了135 g，XXD 组、 MH 组和 DM组体重均没有正常组增加快， XXD组体重平均增加了 32 g，MH 组体重平均增加了 9 g，DM组大鼠体重平均增加了49 g；与正常组比较均表现出极显著的统计学差异（P＜0.001）。

表1 大鼠体重记录（x±s，n=8；单位：g）

注：与NC组比较，*P＜0.05 , **P＜0.01, ***P＜0.001

3.3 饮水量

糖尿病大鼠由于血糖升高导致尿糖增加，尿糖增加引起尿渗透压升高，渗透利尿引发多尿现象，多尿再引起体内血容量减少，进而引起血浆渗透压升高，刺激口渴中枢，引起口渴，并导致多饮。由表2可以明显看出，在造模后，大鼠的饮水量出现了明显的增加，平均模型组每组每只大鼠的饮水量比正常组平均增加了约75～125 mL。给药8 w，正常大鼠的饮水量基本保持在一个较稳定的状态，DM组饮水量有下降趋势，每只模型大鼠的饮水量平均减少了40 mL ；而XXD组每只大鼠的饮水量平均减少了71 mL，MH组每只大鼠的饮水量平均减少了75 mL，两组的饮水量均表现出明显的降低趋势，具有极显著差异（P＜0.001）。

表2 给药后大鼠饮水量记录（x±s，n=8；单位：mL）

3.4 进食量

由于大量的排尿，导致体内糖分丢失严重，机体始终处于饥饿状态，因此导致糖尿病患者多食多餐。由表3可知，给与 STZ 造模后，大鼠进食量增加。给药8 w，正常大鼠的进食量基本保持在一个较稳定的状态，DM组大鼠进食量平均增加了1.1 g；而XXD组大鼠进食量平均减少了6.1 g，MH组大鼠进食量平均减少了12.3 g，两组的进食量均表现出明显的降低趋势，具有极显著差异（P＜0.001）。

表3 给药后每组每只大鼠进食量记录（x±s，n=8；单位：g）

3.5 空腹血糖 FBG

对大鼠采用白天禁食 6～8 h，取其尾静脉血，测定其空腹血糖浓度。由表4可知，采用50 mg·kg-1的 STZ 对大鼠进行糖尿病造模，在一个月内可以达到预期水平，实验大鼠基本处于高血糖状态。给药8 w，正常大鼠的进食量基本保持在一个较稳定正常血糖值的状态（5～7 mmol·L-1），DM组大鼠空腹血糖值平均降低了4.1 mmol·L-1，有一定程度的降低趋势；而XXD组大鼠空腹血糖值平均降低了7.5 mmol·L-1，MH组大鼠空腹血糖值平均降低了7.1 mmol·L-1，两组的FBG均表现了明显的降低趋势，具有极显著差异（P＜0.001）。

表4 给药后大鼠空腹6h血糖记录(x±s，n=8；单位：mmol·L-1)

3.6 大鼠口服葡萄糖耐量

葡萄糖耐受表明了身体对血糖浓度的调节能力，正常情况下，机体摄入葡萄糖后，或诱导胰岛素的分泌，进而达到降低血糖的目的，然而，糖尿病患者体内由于胰岛素的相对或者绝对缺乏，导致其降血糖能力大大降低。因此，在给予葡萄糖注射后，其血糖会出现久高不下的现象。在给药0、4、8 w将实验大鼠隔夜禁食12 h后，给予每组大鼠灌胃40%的葡萄糖溶液，然后测定0，30，60，90，120 min内大鼠的血糖值，观察其葡萄糖耐受能力。由图2可知，正常对照组大鼠糖耐量正常，口服葡萄糖后，其血糖值在 30 min 达到峰值，随后逐渐下降，并在120 min内恢复到正常水平；模型组糖尿病大鼠血糖值在 30 min 也达到峰值，但其后一直维持在较高水平（≥20 mmol·L-1），表明其糖耐量受损，说明胰岛素的作用减弱，可能是由于胰岛素缺乏或者是胰岛素敏感性降低导致。与模型组糖尿病大鼠比较，灌胃三黄泻心汤和二甲双胍 8 w后，其血糖值在 30 min达到峰值，随后以较快速度下降，但未能恢复到初始水平，表明三黄泻心汤和二甲双胍可改善糖尿病大鼠的糖耐量。由图3可知，糖尿病模型组大鼠较正常组大鼠AUC增加了4.77倍，而灌胃三黄泻心汤和二甲双胍8 w后其AUC分别降低了11.72%和13.23%（P＜0.05），进一步证实了三黄泻心汤对实验性糖尿病大鼠机体糖代谢紊乱的改善作用。

图2 三黄泻心汤对糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影响

图3 三黄泻心汤给药8w对糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影响

4 讨论

4.1 高糖高脂饲料+链脲佐菌素所致的糖尿病大鼠模型成功

糖尿病是当今世界备受关注的重大慢性疾病，其发病人数多，范围广，在世界范围内共计有超过4亿人患有糖尿病，其中 90%以上为Ⅱ 型糖尿病[11～12]。糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，由于现代社会人们生活水平的提升，饮食习惯更偏向于肉食的转变，工作压力的增加以及身体锻炼的缺乏，导致Ⅱ型糖尿病发病率极高，在中国有近1亿的成年人患有Ⅱ 型糖尿病，老年患病人数尤甚。在药理、药效、药物代谢的研究过程中，因为需要更好的贴近实际情况，常常采用相对应的病理动物模型进行研究。本实验旨在通过链脲佐菌素（STZ）结合高热量饲料建立一种Ⅱ型糖尿病大鼠模型的构建方法。实验选取 90±10 g 的SD 雄性大鼠作为实验对象，采用高脂高糖饲料喂食一月，诱导其产生胰岛素抵抗，然后腹腔注射50 mg·kg-1的 STZ，继续喂食高脂高糖饲料一月后，对模型进行验证，主要检测指标包括体重、饮水量、进食量、空腹血糖浓度和口服葡萄糖耐受。实验结果表明，此剂量下的STZ 对实验大鼠的毒害作用适中，导致的死亡率不足 10%。通过对其体重、饮水量、进食量的长期监控，以及观察其排尿量，造模后的大鼠出现了典型的“三多一少”症状，这一点符合糖尿病症状。模型大鼠空腹血糖始终高于正常水平，在造模4 w 后，其平均血糖浓度高于 20 mmol·L-1。高血糖意味着糖尿病的产生，因此实验方法能够建立科学合理的Ⅱ 型糖尿病大鼠模型。

4.2 三黄泻心汤对Ⅱ 型糖尿病大鼠的降血糖作用研究

本课题采用三黄泻心汤临床治疗糖尿病的剂量来开展实验性糖尿病模型大鼠的降血糖研究，通过8 w 的治疗时间发现，糖尿病大鼠空腹血糖和口服葡萄糖耐量得到了显著的改善，体重也有所增加。因此，三黄泻心汤对Ⅱ 型糖尿病大鼠具有明显的降血糖作用。但是降血糖并不是糖尿病的唯一指标，因此本实验后续还要开展三黄泻心汤对糖尿病大鼠的降血糖的机制研究，以及相关病理学指标研究，以期综合评价三黄泻心汤对实验性糖尿病大鼠的降血糖作用。

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