山楂叶总黄酮对NAFLD肝细胞凋亡影响的研究

黎运呈 曾芳 王秋景 郑迪 杨喆娟

随着人们生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患者日益增多。NAFLD进一步发展，约15%患者发展至肝硬化，3%进展至最终的肝衰竭[1-3]。NAFLD是一类肝组织学改变与酒精性肝病相类似，但无过量饮酒史的临床病理综合征[4]。NAFLD在临床上以肝功能异常为主要表现，肝细胞的病理损伤尤以肝细胞线粒体损伤较为显著。线粒体是肝细胞重要的细胞器之一，同时也是具有完整结构和生化功能复杂、多变的细胞器，细胞内和细胞外环境的变化可导致线粒体的结构和功能异常，而肝线粒体的病变与细胞凋亡的发生密切相关[5-6]。现代药理学研究表明，山楂叶总黄酮（hawthorn leaves flavonoids，HLF）具有降血脂、抗氧化、降糖、抗血小板聚集等作用[7-8]。笔者通过观察HLF对NAFLD细胞凋亡的影响，旨在揭示NAFLD发病的分子机制，为中药干预治疗NAFLD提供理论依据，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HLF（长春三九生物制药，批号：20140823）；人正常肝细胞L-02株，购自中科院上海细胞研究所细胞库；FBS购自杭州四季青公司；油酸（OA）购自天津风船化学试剂科技有限公司；软脂酸（PA）、油红O、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司;达氏修正依氏培养基（DMEM）和小牛血清（FCS）购于美国Gibco公司；TG试剂盒、考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程公司。化学药品与试剂：Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购于美国BD公司；MTT购于瑞士罗氏公司；SDS-PAGE试剂购于美国Sigma公司；PVDF膜购于德国 Millipore公司；Caspase-9、Bcl-2、Bax和 β-actin抗体购于Cell Signaling Technology；羊抗兔和羊抗鼠二抗购于美国Bethyl公司。Cytochrome C购于美国Bio－Vision公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人正常肝L-02细胞用含有10%FBS的DMEM培养液，于37℃、含5%CO2的温箱中培养72h，细胞70%～80% 融合时，以0.25%胰酶/0.02%EDTA消化传代，更换培养液。

1.2.2 NAFLD实验分组 取对数生长期的细胞1×105/ml种植到6孔板，并孵育24h后，实验分为正常组、模型组、低剂量组（HLF 100μg/ml）和高剂量组（HLF 400μg/ml），每组4瓶细胞。正常组用MEM培养液换液，而模型组、低剂量组和高剂量组，换液时换成含有1mmol/L，FFA 混合物（OA∶PA=2∶1） 的 10%FBS 的MEM培养液诱导。实验重复5次，每组4个培养瓶。诱导24、48、72h后收集细胞，分别进行油红O染色、显微镜观察、计算细胞活力和TG测定等，确定细胞模型。

1.2.3 细胞形态学观察 不同剂量HLF作用L-02细胞共48h，显微镜下观察正常组、模型组、低剂量组、高剂量组的细胞形态学变化。

1.2.4 细胞凋亡检测 采用Annexin V和PI双染的方法检测凋亡细胞。不同浓度HLF作用于L-02细胞48h后，用0.25%胰酶消化并收集细胞。1 500 r/min离心5 min，4℃，细胞用PBS洗2次，弃上清液，细胞在4℃下的稀释结合液中重悬。取Annexin V-FITC溶液5 μl和PI 2.5 μl加到 100 μl细胞悬液中，混匀，避光，在冰水中孵育10 min。加稀释的结合液400 μl到细胞悬液中混匀后上流式细胞仪检测，于激发波长488 nm处测定细胞凋亡率，并采用CellQuest流式软件分析。

1.2.5 凋亡蛋白表达检测 不同浓度HLF作用于L-02细胞48h后，用0.25%胰酶消化收集细胞。Western blot法检测 Bcl-2、Bax、Caspase-9及 Cytochrome C 蛋白表达。采用 mitochondria/cytosol fractionation kit（Bio－Vision,Mountain View,CA）试剂盒说明书将线粒体及细胞溶质分开。提取蛋白后采用12%SDS-PAGE胶分离蛋白条带，然后转移到PVDF膜。膜采用含5%脱脂牛奶的 TBST 液[10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L氧化钠和 0.05%Tween-20]封闭，分别采用Bcl-2（1：1 000），Bax（1：1 000），Caspase-9（1：1000），Cytochrome C（1：1 000）和 β-actin（1：1 000）抗体过夜。用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（1：2 000）或羊抗鼠（1：2 000）二抗孵育1 h，过氧化物酶的活力被采用ECL显影的方法检测条带。采用凝胶成像仪上机检测，并用Quantity One软件定量分析。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件，计量资料均以表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者组间两两比较采用LSD-t检验，方差不齐者组间两两比较用Tamhane′s T2法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞凋亡形态学变化 不同浓度HLF作用NAFLD的模型细胞48h，倒置显微镜下观察凋亡细胞形态学改变。在FFA作用于细胞后，部分细胞生长被抑制，HLF药物干预后，细胞凋亡明显被抑制。在造模过程中，细胞在FFA的作用下生长受到抑制，细胞的变化主要表现为：细胞体积变小，分散排列，核浆比例降低，细胞膜皱缩起泡，细胞界限表现褶皱和浓染，细胞质出现透明空泡，呈辐射状，叶状突起。进一步发展，出现细胞膜出泡和凋亡小体形成。细胞体积明显变小，细胞间隙明显增大，边界更清晰，凋亡形态也更加明显。通过HLF药物干预，随着浓度的增加，L-02细胞形态改变明显好于低剂量组及模型组。详见图1（见插页）。

2.2 NAFLD细胞的凋亡率 Annexin V-FITC标记凋亡细胞，而PI标记坏死和中晚期凋亡细胞。Annexin VFITC代表水平轴的绿色荧光强度，PI代表垂直轴的红色荧光强度。不同浓度HLF作用NAFLD细胞48h，随着HLF浓度的增加，早期和总的凋亡率较未干预的模型组明显好转，且与浓度增高相关，详见图2。模型组与正常组相比较，细胞总凋亡率明显增高，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）；经过HLF干预后，模型组与高剂量组比较，早期凋亡率有统计学意义（P＜0.05），中晚期及总凋亡率有统计学意义（P＜0.01）。低剂量组与高剂量组相比较，中晚期凋亡率有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

2.3 NAFLD细胞凋亡蛋白的表达 随着HLF作用浓度的增加，Bax、Cytosolic Cytochrome C蛋白表达水平逐渐降低，且Cleaved Caspase-9的活化也减少。然而，随着 HLF作用浓度的增加，Bcl-2、Mitochondria Cytochrome C蛋白表达水平逐渐增加。详见图3。不同浓度HLF作用时，Bax/Bcl-2的比值，与模型组比较，高、低剂量组均有统计学意义（P＜0.01），高、低剂量组之间比较有统计学差异（P＜0.01）；Cytosolic/Mitochondria Cytochrome C的比值，与模型组比较，高、低剂量组均有统计学意义（均P＜0.01），高、低剂量组之间比较有统计学差异（P＜0.05）；Cleaved Caspase-9蛋白的表达，与模型组比较，高、低剂量组均有统计学意义（P＜0.01），高、低剂量组之间比较无统计学差异（P＞0.01），详见表 2。

图1 不同浓度HLF作用NAFLD细胞模型48h时倒置显微镜下检测形态学改变（×400）

图2 Annexin V-FITC/PI双染检测不同浓度HLF作用后NAFLD细胞的凋亡率（a区：机械损伤细胞，Annexin V-/PI+；b区：中晚期凋亡和坏死细胞，Annexin V+/PI+；c区：早期凋亡细胞，Annexin V+/PI-；d 区：正常活细胞，Annexin V-/PI-；b+c：总凋亡细胞）

表1 各组细胞凋亡率的比较（%）

图3 Western blot法检测不同浓度HLF作用于NAFLD细胞48h时 细 胞 的 Bax、Bcl-2、Mitochondria Cytochrome C、Cytosolic Cytochrome C及Cleaved Caspase-9的蛋白表达水平

3 讨论

NAFLD的发病目前认为与脂肪酸的代谢异常、胰岛素抵抗、细胞的氧化应激、肝细胞的凋亡等方面密切相关。随着对线粒体功能的深入研究，线粒体在细胞凋亡中起着关键作用[9-10]。

表2 各组细胞凋亡蛋白表达水平的比较

细胞凋亡被分为外源性死亡受体通路和内源性线粒体通路[11-12]。在内源性凋亡途径中，Bcl-2家族改变线粒体膜电位进而打开线粒体孔道，导致线粒体中的细胞色素C（Cytochrome C）大量释放，细胞质中增多的Cyt-C（Cytosolic Cyto-chrome C）与ATP和凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）共同作用，激活了 Caspase-9、Caspase-3和PARP，诱导了细胞凋亡。在线粒体调控凋亡的系统中，Bcl-2及其家族构成一个复杂且相互作用的调控细胞凋亡的网络[13-15]。在NAFLD的形成过程中，Bcl-2和Bax扮演着重要的角色，脂肪变性和氧化应激使得Bax的合成和转移到线粒体外膜的Bax增加，导致线粒体膜构型的改变，PT孔开放、细胞色素C的释放，引起细胞的凋亡；Bcl-2主要分布于线粒体外膜，其同源二聚体抑制PT孔开放，且能与Bax结合，阻止Bax的构型变化而起到抗凋亡的作用[16-19]。Cyt-C和Caspase-9均为促凋亡蛋白。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，Bax属于促凋亡蛋白。两者的比值决定了细胞对凋亡的敏感性甚至可喻为细胞“凋亡开关”[20]。

本实验在显微镜下观察NAFLD细胞模型的凋亡形态，发现在FFA作用细胞后，模型组细胞生长被抑制，部分细胞可见凋亡；在不同浓度HLF作用后，肝细胞形态学改变有一定程度的好转。运用Annexin VFITC/PI双染检测NAFLD细胞的凋亡率，可见模型组细胞的凋亡率与正常组相比明显增高，两者比较有统计学差异（P＜0.01）；经过不同浓度HLF干预后，随着HLF作用浓度的增加，早期和总的凋亡率较未干预的模型组明显好转，随着浓度增高细胞凋亡率明显下降，模型组与高剂量组比较，早期凋亡率有统计学差异（P＜0.05），在中晚期及总凋亡率比较有统计学差异（P＜0.01）。低剂量组与高剂量组相比较，早期凋亡率及总凋亡率比较无统计学差异，中晚期凋亡率比较有统计学差异（P＜0.05）。本研究显示NAFLD肝细胞在FFA作用细胞后，模型组细胞有明显的形态学改变，存在生长被抑制、出现凋亡小体，通过HLF干预后，形态学改变有明显好转，肝细胞的凋亡率有明显降低且与药物浓度有关，差异有统计学意义。

运用Western blot检测蛋白表达的结果表明，与凋亡密切相关的 Bax蛋白、Cytosolic Cytochrome C、Cleaved Caspase-9在NAFLD肝细胞模型中的表达均较正常组增加，而NAFLD细胞模型组中Bcl-2蛋白、Mitochondria Cytochrome C蛋白表达水平明显低于正常组。经过HLF干预后，随着HLF浓度的增加Bcl-2蛋白、Mitochondria Cytochrome C蛋白表达水平较模型组也逐渐增加,而 Bax蛋白、Cytosolic Cytochrome C、Cleaved Caspase-9相应减少。本研究还表明，模型组Bax/Bcl-2、CytosolicCytochromeC/MitochondriaCytochrome c的比值、Cleaved Caspase-9蛋白表达均较正常组升高，两组比较有统计学差异（P＜0.01）；运用高、低浓度HLF作用NAFLD肝细胞时，Bax/Bcl-2、Cytosolic Cytochrome c/Mitochondria Cytochrome C的比值，Cleaved Caspase-9蛋白的表达均有不同程度下降，与模型组相比较，HLF高、低剂量组有统计学差异（P＜0.05）。降低Bax/Bcl-2和Cytosolic Cytochrome C/Mitochondria Cytochrome C比值的作用，高、低剂量组之间比较有统计学差异（P＜0.05或 0.01）；降低Cleaved Caspase-9凋亡蛋白表达的作用，高、低剂量组之间比较无统计学差异（P ＞0.05）。

结合文献报道，Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Cleaved Caspase-9均与细胞内源性凋亡相关，本实验结果表明，HLF对NAFLD细胞凋亡的影响可能是通过调节线粒体 Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Cleaved Caspase-9 等相关凋亡蛋白的表达，稳定线粒体功能而实现调控肝细胞的凋亡。通过调节肝细胞线粒体的功能来延缓或阻止NAFLD的进展，为临床治疗NAFLD提供了又一条思路。

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