系统性红斑狼疮患者B细胞中microRNA-155的表达及干预后效应

陈阿琼 黄茜茜 叶璐璐 薛向阳 林巧爱 朱小春 李声东

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及多系统的慢性自身免疫性疾病，针对细胞核抗原产生自身反应性抗体是其主要标志[1]。SLE患者的B细胞受损且不能区分自身抗原和非自身抗原，导致产生针对自身抗原的抗体并触发过度炎症反应[2]。microRNAs（miRNAs）是一类小的（21~25个核苷酸）、非编码RNA，其通过与靶向mRNA序列的碱基配对调节转录后基因的表达[3]。有时miRNA可仅以2倍差异表达来调控靶基因从而减少蛋白质表达[4]。因此，相当难以识别在发生某些疾病时产生特定miRNA的生理功能。近年来已经提出miRNAs作为SLE中免疫过程的重要调节剂[5-6]。miR-155为典型的多效miRNA，能广泛调控免疫功能，包括T和B细胞活化，炎症反应和免疫记忆[7]，其通过靶向少数基因如 SHIP1[8]、SCOS1[9]和 S1PR1[10]等增强免疫应答，促进免疫系统的过度活化。在类风湿关节炎、SLE等自身免疫性疾病中均可见其发挥致病作用[11]。在狼疮小鼠模型中，miR-155的缺失减少了自身抗体的产生，可通过调节B细胞增殖来减轻狼疮样疾病[12]。为进一步探究miR-155在SLE患者B细胞中的作用，笔者检测SLE患者和健康人B细胞中miR-155的表达水平，并利用miRNA抑制剂干预后进一步检测IgG水平，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2011年2至12月和2014年6至12月温州医科大学第一附属医院门诊及住院的SLE患者共66例，均符合1997年美国风湿病学会修定的SLE诊断标准，男 9 例，女 57 例，年龄 28～52（39.75±10）岁。选取同院体检中心同期健康体检者10例作为健康对照组，男 2 例，女 8 例，年龄 26～50（38±12）岁，年龄与性别与SLE患者匹配。

1.2 主要试剂与仪器 Tri-Reagent BD试剂购自美国Invirtogen，miRNA检测试剂盒购于德国Qiagen公司，CD19 MicroBeads（human）购于德国 Miltenyi公司，人IgG ELISA检测试剂盒购于瑞典Mabtech公司，人淋巴细胞分离液购于天津灏洋生物公司，DEPC水购自宝生物工程（大连）有限公司，ABI 7500型定量PCR仪为美国应用生物系统公司产品，其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 标本收集 采集新鲜外周静脉血5ml，EDTA抗凝，3 000r/min离心10min，用移液枪吸出上层血浆至1.5ml EP管中，细胞沉淀用于外周血单个核细胞（PBMC）的分离。

1.3.2 PBMC的分离 细胞沉淀采用0.9%氯化钠注射液1：2重悬；取6ml细胞悬液小心缓慢地用吸管加于6ml淋巴细胞分离液的液面之上，400g，离心20min；离心管中分层后，收集第二层的乳白色淋巴细胞放入含0.9%氯化钠溶液4～5ml的试管中，充分混匀。再次离心，400g，离心20min。沉淀经0.9%氯化钠溶液反复洗2次即可得到所需的PBMCs。

1.3.3 外周血B细胞的分离 磁珠分离B细胞采用阴性选择的原理，即被标记的非B淋巴细胞保留在分离柱的磁场内，而未被标记的B淋巴细胞通过了分离柱。流式细胞仪分析磁珠分选的B细胞的得率及纯度。分离的PBMCs细胞计数后，300g，离心10min，彻底吸出上清液；预冷B细胞分离缓冲液，按每107个细胞需40μl的比例加入重悬细胞；根据每107个细胞需10μl的比例加入B细胞抗体鸡尾酒试剂，混匀；放入冰箱（2～8℃）孵育5min；每107个细胞加入30μl B细胞分离缓冲液；每107个细胞加入20μlB细胞分离磁珠试剂，混匀；放入冰箱（2～8℃）孵育10min；将分离柱置于分离器适当的磁场内，缓慢将孵育的细胞悬液加到分离柱中，同时收集流出的未被标记的细胞液；加入500μl缓冲液洗柱，共3次；将分离柱移出分离柱的磁场内，立即加入适当的缓冲液，将标记的细胞推出至收集管中，即可得到分离出的B细胞。

1.3.4 流式细胞仪分析B细胞纯度 重悬细胞并计数。再将细胞悬液分为4管（106个细胞数/管），设置实验组和对照组，加入直接标记的一抗抗体，即抗人CD19-PE（1mg/1ml）5μl，终容量 100μl，具体为：实验组：B细胞+抗人CD19-PE；对照组1：B细胞；对照组2：PBMCs+抗人CD19-PE；对照组3：PBMCs。轻轻混匀后，避光，室温孵育30min；孵育完成后，加入缓冲液PBS，300g离心5min，弃去上清液，重复1次；重悬细胞后，上机检测。

1.3.5 B细胞RNA的抽提 B淋巴细胞（105个细胞数/份）加入TRIzol试剂1ml，充分混匀后室温静置5min；加氯仿 200μl，混匀后冰上静置 5min，4℃，12 000r/min离心15min，可见分层；取上层水相移至新的无酶EP管中，加入等体积异丙醇，充分混匀后，置于-20℃冰箱中过夜；4℃，12 000r/min离心15min，吸出上清液，留白色沉淀；加入1ml75%乙醇，4℃，8 000r/min离心15min后弃上清液；再次离心1min后，吸尽乙醇留白色沉淀；打开EP管盖，冰上晾干至乙醇完全挥发，再加入DEPC处理水20μl溶解RNA，测浓度后-80℃保存。

1.3.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-155的表达 取提取的RNA以miR-155茎环逆转录引物进行逆转录，20μl逆转录反应体系含：miScript Reverse Transcriptase Mix 2μl，10×miScript Nucleics Mix 2μl，5×miScript HiSpec Buffer 4μl，RNase-Free Water variable，Total RNA template 10pg-1μg，混匀，微离心置于冰上；37℃逆转录60min，95℃酶失活5min；-20℃保存逆转录产物cDNA或立即用于real-time PCR。real-time PCR：所用试剂置于冰上，取出制备好的cDNA，每个样本作2个复孔；避光操作，调制20μl反应体系：2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10μl，10× miScript Universal Primer 2μl，10×miScript Primer Assay 2μl,RNase-Free Water variable，Template cDNA ≤2μl。反应起始条件 95℃预变性5min，循环反应条件（40个循环）94℃变性 15s，55℃退火30s，70℃延伸 30s，用 real-time PCR仪附带的软件导出原始数据，获得每个孔中荧光信号到达设定阈值时的循环数，即Ct值。

1.3.7 细胞miRNA干预实验 为评价miR-155对B细胞功能的影响，我们通过miRNA抑制剂下调miR-155的表达，采用ELISA检测细胞上清液IgG水平变化。由于常规的转染方案难以将基因导入B细胞，本研究采用电转染方式对B细胞内的miRNA进行干预。分离外周血单个核细胞，细胞计数，6孔板培养，106个/孔细胞数；清洗电转杯，75%乙醇浸泡1h后，无水乙醇浸泡0.5h后，紫外照射至乙醇完全挥发，放于-20℃过夜；6孔板内分别加入106个细胞及10μl mimics/mimics-NC/miRNA inhibitor/miRNA inhibitor-NC/Control（电转但不加 miRNA）/Blank（不电转也不加 miRNA），混匀，将溶液转移到电转杯中，按250V、10ms设置电转仪参数；将电转杯置于恒温培养箱10min，使miRNA充分进入；将细胞悬液接种于预热的培养基中培养；培养48h后，收集细胞上清液和细胞，待检测。

1.3.8 IgG抗体检测 收集的细胞上清液，12 000r/min，4℃，10min离心备用；从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条；空白孔加标准品和标本通用稀释液，其余孔中加标本或不同浓度标准品（100μl/孔），用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90min；提前20min准备酶标抗体工作液；洗板5次；空白孔加酶标抗体稀释液，其余孔加入酶标抗体工作液（100μl/孔），用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育30min；洗板5次；打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序；加入显色底物（TMB）100μl/孔，避光 36℃孵箱，避光孵育 15min；加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值（3min内）。

1.4 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件，剔除CT值＞35或溶解曲线不合格的数据，计量资料以表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血B细胞分离及纯度鉴定 见图1。

图1 B细胞纯度流式鉴定

由图1可见，A01所示为没有加CD19-PE抗体的B细胞对照管，目的是收集细胞以便划分实验管的细胞区域。A02是加有CD19-PE抗体的B细胞实验管，在对照第一管划分的基础上，PE通道的细胞有约92%，即分离的B细胞纯度能达到约92%。

2.2 SLE患者和健康对照组B细胞miR-155表达水平比较 见图2。

图2 SLE患者和健康对照组B细胞miR-155表达水平比较

由图2可见，与健康对照组比较，miR-155在SLE患者B细胞中表达水平明显上调（t=3.192，P＜0.05）。

2.3 miRNA干预对B细胞分泌IgG的影响 见图3。

图3 B细胞miRNA电转染干预效率流式细胞仪评价

由图3可见，荧光标记的miR-155转染效率后流式细胞仪检测携带荧光的细胞数量，B细胞转染效率约40%。

2.4 SLE患者外周血B细胞miR-155干预48h后IgG水平 见图4。

图4 SLE患者外周血B细胞miR-155干预48h后IgG水平

由图4可见，SLE患者B细胞上调表达的miR-155，通过miRNA抑制剂干预48h后，分泌的IgG水平明显降低（P＜0.05）。

3 讨论

B细胞通过多重途径在SLE发病机制中起到关键作用，其中最主要途径是B细胞产生病理性自身抗体，并通过形成免疫复合物、激活补体和直接细胞毒性引起组织损伤，基于耗竭B细胞的药物，如利妥昔单抗等，在常规临床实践中用于治疗顽固性SLE[13]。有研究发现，miR-155在活化的B细胞中表达且可能发挥着重要作用[14]，Vigorito等[15]发现miR-155缺乏的B细胞出现滤泡外和生发中心反应减少。本研究采用qRT-PCR，发现miR-155在SLE患者B细胞中表达上调。此外，采用miRNA抑制剂降低B细胞中miR-155的表达后，检测到细胞上清液IgG水平明显减少，提示miR-155可调控B细胞产生IgG，进一步证实miR-155是SLE患者B细胞功能相关的miRNA。miR-155在B细胞中如何发挥作用需要进一步研究。Vigorito等[15]通过miR-155-缺陷B细胞中基因表达的全基因组分析，发现总共185个蛋白编码基因受到显着影响，特别是PU.1（Ets家族转录调节子）被鉴定为B细胞中miR-155的功能靶区，野生型原代B细胞中的强制表达PU.1可导致表达IgG1细胞比例降低。多项研究数据表明miR-155-SHIP1轴也可能在调节B细胞活化和存活中起重要作用[8,16]。近期又有研究证实miR-155直接抑制Jumonji家族成员JARID2，从而减少B细胞凋亡[17]。

B细胞的过度活化被认为是SLE重要发病机制，miR-155在B细胞中的调控或许与SLE疾病发生、发展有关。2015年Liu等[18]报道在EBV等特定病毒或细菌感染后，SLE患者B细胞中的miR-155可以在TLR9诱导下靶向作用于CD1d的3′-UTR区域，从而损害B细胞的抗原呈递功能。同年Lou等[19]报道，miR-155与B细胞抗体反应有关。这些报道均证实了miR-155与SLE患者B细胞的功能息息相关。本实验也提示miR-155的过度表达可能通过促进SLE患者B细胞产生IgG，促进自身抗原抗体复合物的形成，从而诱导免疫炎症反应对机体产生损伤。当然，miR-155如何在SLE中调控B细胞发挥致病作用仍需进一步深入研究。

综上所述，miR-155从多方面影响B细胞的功能，本研究也证实miR-155在SLE患者B细胞中表达上调，且抑制miR-155可降低B细胞产生IgG，这也为改善SLE治疗提供可行的新策略。

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