他莫昔芬对乳腺癌MCF- 7细胞侵袭能力的影响及其作用机制

2018-06-13王捷王岩朱芸

癌症进展 2018年5期

王捷，王岩，朱芸

南阳医学高等专科学校第一附属医院1药学部，2外科教研室，3心血管内科，河南南阳473000

乳腺癌是女性恶性肿瘤中占据比例较大且预后不佳的生殖系统疾病[1]。乳腺癌的发病原因与雌激素受体（estrogen receptor，ER）的作用密切相关[2]。ER表达的乳腺癌被称为ER阳性乳腺癌[3]。他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）可与ER结合切断雌激素对乳腺癌细胞的刺激作用，是一种选择性ER调节剂，可阻止癌细胞的生长[4]。但相关研究表明，仅仅抑制ER是不够的，TAM具有类似雌激素的作用，能提高血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEFG）水平，提高肿瘤组织产生新生血管的能力，促进癌细胞的浸润和转移[5]；同时还能提高基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）水平，协同增强新生血管的形成能力。本研究探讨TAM对乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的影响及其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞

乳腺癌MCF-7细胞株购自重庆医科大学基础研究实验室。

1.2 实验仪器与药品

高糖DMEM培养基、无酚红高糖DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；DMSO培养基、TAM、明胶均购自Sigma公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒以及实时荧光定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司。仪器中CO2培养箱购自Thermo公司；制胶、电泳和转印系统，Chemi Doc XRS+凝胶成像系统，CFX Connect实时荧光定量PCR仪均购自Bio-Rad公司。

1.3 细胞培养

MCF-7细胞培养采用含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基在37℃及5%CO2条件下孵育。待细胞融合率达90%时进行传代培养。

1.4 细胞分组及实验方法

取对数生长期MCF-7细胞。给药前将耗竭细胞本身的内源性雌激素改用无血清无酚红高糖DMEM培养基培养24 h。将MCF-7细胞接种至6孔板中，过夜，直至细胞贴壁。设对照组、TAM组。对照组用无血清无酚红高糖DMEM培养基继续培养24 h，TAM组用含1 μmol/L TAM的无血清无酚红高糖DMEM培养基培养24 h，每组5个复孔。

1.5 Western blot法测定MMP- 9、MMP- 2、VEGF蛋白水平

采用BCA蛋白定量法测定MMP-9、MMP-2、VEGF蛋白：向其中加入Loading Buffer在95℃条件下变性15 min，12 000 r/min离心10 min，保存于-80℃冰箱中用于蛋白表达水平检测。将每孔10 μl样品加入含10%的十二烷基硫酸钠（lauryl sodium sulfate，SDS）的聚丙烯凝胶中电泳分离90 min，分离完毕后切胶，制作三明治盒。冰水中转膜2 h。5%脱脂奶粉封闭2 h。一抗（Bcl-2、Bax、Actin，1∶1000）常温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次12 min，二抗（1∶5000）常温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次8 min，加入ECL发光液后，转入暗室，化学发光法曝光感光底片，显影定影洗涤后烘干裁片保存。

1.6 RT-PCR 法测定 MMP- 9、MMP- 2、VEGF mRNA水平

按TRⅠzol试剂说明书要求提取RNA。逆转录反应条件参照TaKaRa M-MLV逆转录酶说明书。PCR反应体系：cDNA1.0 μl，2×Premix Taq 10 μl，上、下游引物各10 pmol，加双蒸水至总体积20 μl。PCR反应条件：94℃5 min预变性；94℃ 30 s变性，59℃45 s退火，72℃1 min延伸，34个循环；72℃延伸 10 min。 β-actin 正义引物序列为 5′-TGGATCCTGTGGCAT-CCATGAAAC-3′，反义引物序列为5′-TAAAACG-CAGTAACAGTCC-3（′350 bp）；Bcl-2正义引物序列为5′-TGCACCTGACGCCCTTCA-3′，反义引物序列为 5′-AGA-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3（′291 bp）；Bcl-xL正义引物序列为5′-ATGTCTCAGAGCAACCGGGAGC-3′，反义为 5′-GCGATCCGACTCACCAATACCT-3（′500 bp）；XⅠAP正义引物序列为5′-ATGATACCATCTTCCAAAATCC-3′，反义为 5′-TTCTGTAATGAAGTCTGACTT-3（′200 bp）。PCR反应结束取产物5 μl于12 g/L琼脂糖凝胶电泳。采用Quantity One软件进行分析，以β-actin作为内参照，以靶基因与β-actin光密度的比值作为mRNA的表达丰度，进行半定量检测。

1.7 Transwell法

采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力，按照文献[6]操作。各组MCF-7细胞侵袭能力=穿过Matrigel胶微孔滤膜的细胞数/空白对照穿过Matrigel胶微孔滤膜的细胞数。

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0统-计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF、MMP- 9、MMP- 2蛋白表达水平的比较

TAM组MCF-7细胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2蛋白表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 两组MCF- 7细胞中VEGF、MMP- 9、MMP- 2蛋白表达水平的比较（%，±s）

组别对照组TAM组t值P值VEGF 100.4±2.1 157.9±13.6 10.235＜0.01 MMP-9 100.9±3.3 181.2±23.8 8.186＜0.01 MMP-2 100.0±1.6 172.4±21.5 8.226＜0.01

2.2 VEGF、MMP- 9、MMP- 2 mRNA表达水平的比较

TAM 组 MCF-7细胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2mRNA相对表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表2 两组MCF- 7细胞中VEG-F、MMP- 9、MMP- 2 mRNA相对表达水平的比较（x± s）

2.3 细胞侵袭能力的比较

TAM组MCF-7细胞的侵袭能力相对数为（34.9±5.9），明显高于对照组的（12.6±3.4），差异有统计学意义（t=8.022，P＜0.01）。（图1）

图1 两组MCF- 7细胞侵袭实验结果（HE染色，×400）

3 讨论

乳腺癌是临床上常见的生殖系统恶性肿瘤，对中国女性的健康危害极大。目前常采用内分泌治疗并取得较满意的效果。雌激素通过调节或拮抗经典的雌激素受体ER-α、ER-β所参与的各个生理过程来实现降低乳腺癌细胞中抗凋亡的Bcl-2表达，增加促凋亡的Bax表达能力，从而促使癌细胞凋亡[7]。TAM为一种非固醇类ER拮抗药，通过竞争性抑制ER发挥抑制增殖分化的能力从而治疗乳腺癌[8]。但近年来的研究发现，TAM也发挥类似雌激素作用[8]，主要体现在其活性代谢产物4-羟基他莫昔芬（4-OHT）具有雌激素样作用，可促进ER-α阴性乳腺癌SR-BR-3细胞的增殖，同时可增强子宫内膜癌Tshikawa和KLE细胞的增殖与侵袭能力，提高其MMP-9、MMP-2蛋白及MMP-9、MMP-2mRNA的表达和活性[9]。提示拮抗ER-α受体治疗乳腺癌具有一定的局限性，需辅助抑制相关雌激素样作用，降低不良反应发生率。

肿瘤组织生长的关键是形成新生血管。VEGF是一种具有强作用的促血管内皮细胞分裂剂[10]。与相应受体结合后刺激血管内皮细胞增生，形成新的血管和基质。研究报道，VEGF表达与乳腺癌预后有关，高水平的VEGF可促进乳腺癌远处转移[11]。有学者认为乳腺癌中VEGF的表达与MMP-2、MMP-9有关，提示VEGF、MMP-2、MMP-9在乳腺癌中协同刺激肿瘤血管形成，促进细胞外基质的降解和癌细胞的侵袭转移[12]。本研究结果显示，TAM组MCF-7细胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2蛋白表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；TAM组MCF-7细胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2mRNA相对表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01），说明TAM在拮抗ER-α受体的同时，发挥雌激素样作用，促进乳腺癌细胞的侵袭和转移，影响预后效果。

目前研究TAM的耐药机制可能为：①ER-α的突变与缺失，主要由于部分耐药肿瘤细胞编码ER-α 351位酪氨酸基因突变，被天冬氨酸占据。②ER-β表达的变化，李鹏程等[13]报道由Fos-Jun异源二聚体与Jun-Jun同源二聚体组成的AP-1转录因子，通过AP-1位点途径的作用，使ER-β异常激活或过度表达，引起乳腺癌患者耐药现象的发生。③生长因子信号通路激活ER，ER和生长因子受体通路之间存在相互作用。研究发现，乳腺癌患者中ER-α、ER-β的高表达可增加生长因子信号蛋白（EGFR/HER2）及下游MAPK的活性，通过EGFR-Ras-Raf-MAPK磷酸级联反应，使ER A/B区的第118位丝氨酸磷酸化，ER以配体非依赖性的方式被激活[14]。④细胞激酶信号转导通路的改变，PⅠ3K/AKT/MTOR和MAPK/EPK信号转导通路是细胞内重要的传导通路，与乳腺癌的发生发展密切相关。MAPK和AKT作为重要的信号转导分子可发挥抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，可直接激活ER，是导致内分泌治疗耐受的关键原因。

本研究结果显示，TAM组MCF-7细胞的侵袭能力相对数明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），其机制可能与提高Bcl-2表达水平，降低BAX水平有关。在不利因素环境下，细胞会在基因调控下发生自动死亡，此过程为凋亡，对维持细胞正常活动具有重要意义。凋亡过程与Bcl-2家族和促凋亡蛋白（BAX）关系密切。Bcl-2可维持线粒体外膜的完整性，防止线粒体内细胞色素C等促凋亡分子进入细胞。BAX则可破坏线粒体外膜的完整性，促进各种凋亡分子进入细胞，发挥促凋亡作用。正常情况下，Bcl-2和BAX形成二聚体，作为调控细胞凋亡过程的开关。当外界条件刺激，二聚体分离，抑制细胞出现凋亡，继而引发肿瘤。已有研究证实，TAM作用于MCF-7细胞可提高乳腺癌细胞中Bcl-2表达水平，降低BAX表达水平[15]。与本研究结果一致。

综上所述，TAM可能发挥类雌激素功能，促进乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力，这与其提高MCF-7细胞中VEGF、MMP-9、MMP-2蛋白表达有关。

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