BRAFV600E及TERT启动子突变在甲状腺微小乳头状癌风险评估中的价值

薛金才，刘勤江，田尤新，侯小峰

甘肃省肿瘤医院头颈外科，甘肃 兰州 730050

近年来甲状腺癌的发病率迅速上升，其中甲状腺微小乳头状癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）占很大比例（31%～54%）［1］。PTMC是指直径≤1.0 cm的甲状腺乳头状癌，是1988年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）在甲状腺癌的组织学分类标准中取代了原来隐性癌的概念而规定的［2］。大多数PTMC预后良好，但有少部分PTMC可能预后不良。若能发现分子诊断标志物精准的预测其预后情况，就能更好地指导临床制定诊疗方案。本研究分析BRAFV600E与端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）启动子突变情况及与PTMC危险因素的相关性，期望为临床PTMC的风险评估提供帮助。

1 材料和方法

1.1 研究对象及方法

回顾性分析甘肃省肿瘤医院头颈外科2014年10月—2016年6月首诊治疗的107例PTMC患者，其中男性24例，女性83例。年龄14～76岁，平均年龄（44.0±11.8）岁，＜45岁48例，≥45岁59例。肿瘤大小≤5 mm 38例，＞5 mm 69例。多灶肿瘤28例，单发79例。侵犯包膜41例，未侵犯包膜66例。不良病理亚型（高细胞亚型、柱状细胞亚型及嗜酸细胞亚型等）19例，无不良病理亚型88例。无淋巴结转移N0期64例，有淋巴结转移pN1期（N1a期+N1b期）43例（表1）。所有研究对象均无既往肿瘤病史，进行统一规范手术治疗并病理确诊。本研究经过甘肃省肿瘤医院伦理委员会批准备案，入组前本着自愿原则，与研究对象及家属签署知情同意书。

1.2 测序方法

采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）直接测序法检测BRAFV600E及TERT启动子突变的情况，TERT启动子包括C228T及C250T位点。用4%甲醛溶液固定肿瘤组织，经石蜡包埋后进行5～10 μm厚度切片。取1张切片进行常规H-E染色后由病理医师鉴定并评估肿瘤细胞含量，另取2～4张切片提取基因组DNA后进行PCR扩增。电泳检测PCR扩增产物质量后，将质量较高的PCR扩增产物进行DNA测序，结果分别与BRAF和TERT基因序列进行比对，确认是否发生突变。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行相关数据的统计学分析。各变量的单因素分析采用χ2检验，多因素分析采用二元logistic回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PTMC的BRAFV600E突变分析

P T M C的B R A FV600E突变率为6 8.2%（73/107）。性别、年龄、肿瘤大小、原发病灶数目及有无不良病理亚型的变化与BRAFV600E突变均无显著相关性（P均＞0.05）。有无被膜侵犯及淋巴结转移与BRAFV600E突变均有显著相关性（P 均＜0.01）。多因素Logistic分析显示，与BRAFV600E突变显著相关的因素包括甲状腺被膜侵犯（P=0.012）及淋巴结转移（P=0.000，表1、2）。

2.2 PTMC的TERT启动子突变分析

PTMC的TERT启动子突变率为11.2%（12/107），其中TERT C228T位点突变率为66.7%（8/12）、TERT C250T位点突变率为33.3%（4/12）。年龄、性别、有无被膜侵犯、有无不良病理亚型及淋巴结转移与TERT启动子突变均有显著相关性（P均＜0.05）。肿瘤大小及原发病灶数目与TERT启动子突变均无显著相关性（P＞0.05）。多因素Logistic分析显示，男性（P=0.004）、年龄＜45岁（P=0.026）、甲状腺被膜侵犯（P=0.004）、不良病理亚型（P=0.030）及淋巴结转移（P=0.043）与TERT启动子突变均有显著相关性（表1、2）。

2.3 甲状腺微小乳头状癌BRAFV600E和TERT启动子同时突变分析

甲状腺微小乳头状癌TERT启动子突变12例，其中9例（75%）同时伴有BRAFV600E突变。年龄、性别、有无被膜侵犯、有无不良病理亚型及淋巴结转移与BRAFV600E和TERT启动子同时突变均有显著相关性（P均＜0.05）。肿瘤大小及原发病灶数目与BRAFV600E和TERT同时突变均无显著相关性（P均＞0.05）。多因素Logistic分析显示，男性（P=0.022）、甲状腺被膜侵犯（P=0.023）、不良病理亚型（P=0.041）及淋巴结转移（P=0.030）与BRAFV600E和TERT启动子同时突变均有显著相关性（表1、2）。

表1 PTMC的BRAFV600E和TERT启动子突变与临床病理特征的相关性Tab1 Relationship of BRAFV600E and TERT promoter mutations with clinicopathological features of PTMC

3 讨 论

PTMC是甲状腺乳头状癌最常见的特殊类型，大多数PTMC处于低危状态，预后良好。Yu等［3］在1项纳入18 445例PTMC的Meta分析中指出，PTMC的15年生存率约90.7%。但是部分PTMC具有高侵袭性的临床病理特点［4-6］，可出现原发灶很小而有颈部转移，甚至全身多发转移。有研究显示，PTMC与甲状腺乳头状癌的临床特征和生物学行为相似，治疗方案应一致［7-8］。多年来对于PTMC的治疗一直存在争议［9］，甚至出现了“过犹不及”的声音。如何在众多PTMC患者中筛查出高危人群，做到有的放矢的治疗呢？这需要借助于分子病因学及分子影像学等相关学科的进一步发展［10-12］。

目前对于PTMC风险评估的关键指标包括肿瘤直径、多灶性、被膜受侵、不良病理亚型及淋巴结转移等［13］，大多以回顾性研究及术后病理学检查结果为主，对术前评估及术中指导价值有限。临床迫切需要发现更多分子标志物用于诊断、预后评估寻找新的治疗靶点。筛选出对PTMC治疗有价值的分子生物学标志物，对于制定合理规范的诊疗方案显得尤为重要。BRAF、TERT及TP53等基因突变的检测有助于解决PTMC的风险分层、预后预测及治疗靶点等问题［14］。

BRAF基因是由Ikawa等［15］在人类尤文氏肉瘤中发现的一个能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列，BRAF基因T1799A位点突变可引起MAPK通路激活，从而促进细胞增殖和癌变，与甲状腺癌的发生、发展密切相关［16］。BRAFV600E是甲状腺癌较常见的突变基因之一，诊断特异度高达100%，灵敏度性达到85.1%［17］。但随着分子生物学检测技术灵敏度的提高，BRAFV600E基因突变在甲状腺癌中的检出率越来越高，BRAF基因突变作为独立预后指标存在争议［18］。

多项研究显示，BRAF基因突变与甲状腺乳头状癌的发生、发展、复发和预后密切相关，可以用于评估甲状腺乳头状癌的危险程度［19-20］。Xing等［21］的研究显示，BRAF基因突变对甲状腺乳头状癌的复发有预后价值。一项Meta分析发现，2 470例甲状腺乳头状癌患者中，BRAFV600E突变型比BRAF野生型具有更高的复发率（24.9%vs 12.6%），BRAFV600E突变与肿瘤侵袭性特征呈正相关［22］。Zheng等［23］对997例PTMC患者的研究发现，BRAF基因突变患者淋巴结转移率更高（50.8% vs 5.1%，P＜0.05），是淋巴结转移的独立危险因素（OR=1.96，P=0.03）。Lin等［24］的研究显示，BRAF基因突变的PTMC患者侧方淋巴结转移率高（65% vs 23%，P=0.002）。

有些学者持反对意见，Czarniecka等［25］的研究显示，肿瘤复发主要与淋巴结转移和甲状腺包膜受侵有关，与BRAFV600E突变无关。BRAF状态与复发及无病生存率无关(P=0.76)。还有研究显示，BRAF基因突变并没有增加PTMC的侵袭性［26］。Takacsova等［27］通过一项199例样本量的单中心回顾性研究，评估BRAFV600E突变对于甲状腺乳头状癌复发的预后价值，结果表明，年龄＜35岁及≥60岁的高危组BRAFV600E突变者比低危组BRAFV600E未突变者，局部残留和复发率分别增加17.28和33.49倍。Wang等［28］报道了国内最早关于BRAF基因突变的研究，其结果表明，BRAF突变与甲状腺乳头状癌预后无相关性，仅与患者的年龄相关。由此可见，BRAF基因突变预后价值较为复杂，应与其他分子相关联或与其他临床病理因素联合用于肿瘤的预后分析。

本研究结果显示，PTMC的BRAFV600E突变率为68.2%（73/107）。性别、年龄、肿瘤大小、原发病灶数目及有无不良病理亚型与BRAFV600E突变均无显著相关性（P均＞0.05）。有无被膜侵犯及淋巴结转移与BRAFV600E突变均有显著相关性（P均＜0.01）。多因素logistic分析显示，PTMC与BRAFV600E突变显著相关的因素包括甲状腺被膜侵犯及淋巴结转移。

2013年Liu等［29］首次在甲状腺癌中发现TERT启动子突变。De Biase等［30］的研究发现，431例PTMC患者的TERT启动子突变率为4.7%。Qasem等［31］认为TERT启动子突变与肿瘤大小有关，而在另一项研究中，TERT启动子突变与肿瘤大小无关［32］。本研究发现，PTMC的TERT启动子突变率为11.2%（12/107），年龄、性别、有无被膜侵犯、有无不良病理亚型及淋巴结转移与TERT启动子突变均有显著相关性（P均＜0.05）。肿瘤大小及原发病灶数目与TERT启动子突变均无显著相关性（P均＞0.05）。多因素logistic分析显示，男性、年龄＜45岁、甲状腺被膜侵犯、不良病理亚型及淋巴结转移与TERT启动子突变均有显著相关性。

有研究显示，BRAFV600E与TERT启动子突变的发生呈正相关［33］，唐新月等［34］的研究显示，BRAFV600E与TERT启动子联合突变具有一定协同作用。本研究发现，PTMC的BRAFV600E突变与性别、年龄、肿瘤大小、原发病灶数目及有无不良病理亚型均无显著相关性（P均＞0.05）。但是合并TERT突变后，这些临床病理参数发生变化，出现显著相关性（P＜0.05），多因素logistic分析显示，男性、甲状腺被膜侵犯、不良病理亚型及淋巴结转移与BRAFV600E和TERT同时突变均有显著相关性，而这些参数是PTMC复发的危险因素，提示联合检测BRAFV600E及TERT启动子突变对PTMC分险评估有重要价值。

PTMC预后好，治疗争议多，相关分子生物学研究目前尚无定论。关于BRAFV600E突变的研究已经多有报道，然而有关BRAFV600E和TERT启动子同时突变的研究，国内报道较少，国外主要集中于临床分期晚或预后差的肿瘤中，针对PTMC的研究仍较少见。本研究结果显示，同时出现BRAFV600E和TERT启动子突变可能与PTMC的不良预后相关，但机制尚不明确。联合检测BRAFV600E和TERT启动子突变对PTMC的预后评估有重要价值，可能成为PTMC不良预后的分子诊断指标。

［1］ MORRIS L G, SIKORA A G, TOSTESON T D, et al. The increasing incidence of thyroid cancer: the influence of access to care［J］. Thyroid, 2013, 23(7): 885-891.

［2］ HEDINGER C, WILLIAMS E D, SOBIN L H. The WHO histological classification of thyroid tumors:a commentary on the second edition［J］. Cancer, 1989, 63(3): 908-911.

［3］ YU X M, WAN Y, SIPPEL R S, et al. Should all papillary thyroid microcarcinomas be aggressively treated? An analysis of 18 445 cases［J］. Ann Surg, 2011, 254(4): 653-660.

［4］ LIM Y C, CHOI E C, YOON Y H, et al. Central lymph node metastases in unilateral papillary thyroid microcacinoma［J］.Br J Surg, 2009, 96(3): 253-257.

［5］ KIM N H, BEAK S K, BAIK S H, et al. A patient with micropapillary thyroid carcinoma and macronodular lung metastasis:stable disease for eight years without treatment［J］.Thyroid, 2009, 19(3): 309-311.

［6］ GODBERT Y, HENRIQUES-FIGUEIREDO B, CAZEAU A L,et al. A papillary thyroid microcarcinoma revealed by a single bone lesion with no poor prognostic factors［J］. Case Rep Endocrinol, 2013, 2013(5): 719304.

［7］ PARK Y J, KIM Y A, LEE Y J, et al. Papillary microcarcinoma in comparison with larger papillary thyroid carcinoma in BRAFV600Emutation, clinicopathological features, and immunohistochemical findings［J］. Head Neck, 2010, 32(1):38-45.

［8］ OGILVIE J B, PATEL K N, HELLER K S. Impact of the 2009 American Thyroid Association guidelines on the choice of operation for well-differentiated thyroid microcacinomas［J］.Surgery, 2010, 148(6): 1222-1226.

［9］ 刘红刚. 加强对甲状腺微小乳头状癌的深入探讨［J］. 中华病理学杂志, 2016, 45(6): 361-363.

［10］ XING M C, SA A, KATHRYN A, et al. Association between BRAFV600Emutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer［J］. JAMA, 2013, 309(14): 1493-1501.

［11］ ADRIENNE L, MELCK L Y, SALLY E C. The utility of BRAF testing in the management of papillary thyroid cancer［J］. The Oncologist, 2010, 15(12): 1285-1293.

［12］ NIKIFOROVA M N, WALD A I, ROY S, et al. Targeted next-generation sequencing panel (ThyroSeq) for detection of mutations in thyroid cancer［J］. J Clin Endocrinol Metab,2013, 98(11): 1852-1860.

［13］ 彭 琛, 魏松锋, 郑向前, 等. 1 401例甲状腺微小乳头状癌临床病理特征及中央区淋巴结转移危险因素分析［J］. 中国肿瘤临床, 2016, 43(3): 95-99.

［14］ 中国抗癌协会甲状腺癌专业委员会(CATO). 甲状腺微小乳头状癌诊断与治疗中国专家共识(2016版)［J］. 中国肿瘤临床, 2016, 43(10): 405-411.

［15］ IKAWA S, FUKUI M, UEYAMA Y, et al. B-raf, a new member of the raf family, is activated by DNA rearrangement［J］. Mol Cell Biol, 1988, 8(6): 2651-2654.

［16］ 王先明. 基因检测与分子靶向治疗在甲状腺癌治疗中的热点与展望［J］. 医学与哲学, 2015, 36(10B): 9-12.

［17］ ZHANG Y Z, XU T, CUI D, et al. Value of TIRADS, BSRTC and FNA-BRAFV600Emutation analysis in differentiating highrisk thyroid nodules［J］. Scientific Reports, 2015, 5: 16927.

［18］ YARCHOAN M, LIVOLSI V A, BROSE M S. BRAF mutation and thyroid cancer recurrence［J］. J Clin Oncol, 2015, 33(1):7-8.

［19］ XING M, ALZAHRANI A S, CARSON K A, et al. Association between BRAFV600Emutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer［J］. JAMA, 2013, 309(14): 1493-1501.

［20］ TUFANO R P, TEIXEIRA G V, BISHOP J, et al. BRAF mutation in papillary thyroid cancer and its value in tailoring initial treatment: a systematic review and meta-analysis［J］.Medicine (Baltimore), 2012, 91(5): 274-286.

［21］ XING M, ALZAHRANI A S, CARSON K A, et al. Association between BRAFV600Emutation and recurrence of papillary thyroid cancer［J］. J Clin Oncol, 2015, 33(1): 42-50.

［22］ GANDOLFI G, SANCISI V, PIANA S, et al. Time to reconsider the meaning of BRAFV600Emutation in papillary thyroid carcinoma［J］. Int J Cancer, 2015, 137(5): 1001-1011.

［23］ ZHENG X, WEI S, HAN Y, et al. Papillary microcarcinoma of the thyroid:clinical characteristics and BRAFV600Emutational status of 977 cases［J］. Ann Surg Oncol, 2013, 20(7): 2266-2273.

［24］ LIN K L, WANG O C, ZHANG X H, et al. The BRAF mutation is predictive of aggressive clinicopathological characteristics in papillary thyroid microcarcinoma ［J］. Ann Surg Oncol, 2010,17(12): 3294-3300.

［25］ CZARNIECKA A, KOWAL M, RUSINEK D, et al. The risk of relapse in papillary thyroid cancer (PTC) in the context of BRAFV600Emutation status and other prognostic factors［J］.PLoS One, 2015, 10(7): e0132821.

［26］ WALCZYK A, KOWALSKA A, KOWALIK A, et al. The BRAFV600Emutation in papillary thyroid microcarcinoma: does the mutation have an impact on clinical outcome?［J］. Clin Endocrinol(Oxf), 2014, 80(6): 899-904.

［27］ TAKACSOVA E, KRALIK R, WACZULIKOVA I, et al. A different prognostic value of BRAFV600Emutation positivity in various age groups of patients with papillary thyroid cancer［J］. Neoplasma, 2017, 64(1): 156-164.

［28］ WANG Y L, WANG J C, WU Y, et al. Incidentally simultaneous occurrence of RET/PTC, H4-PTEN and BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma［J］. Cancer Lett, 2008, 263(1):44-52.

［29］ LIU X, BISHOP J, SHAN Y, et al. Highly prevalent TERT promoter mutations in aggressive thyroid cancers［J］. Endocr Relat Cancer, 2013, 20(4): 603-610.

［30］ DE BIASE D, GANDOLFI G, RAGAZZI M, et al. TERT promoter mutations in papillary thyroid microcarcinomas［J］.Thyroid, 2015, 25(9):1013-1019.

［31］ QASEM E, MURUGAN A K, AL-HINDI H, et al. TERT promoter mutations in thyroid cancer: a report from a Middle Eastern population［J］. Endocr Relat Cancer, 2015, 22(6):901-908.

［32］ MUZZA M, COLOMBO C, ROSSI S, et al. Telomerase in differentiated thyroid cancer: promoter mutations, expression and localization［J］. Mol Cell Endocrinol, 2015, 399: 288-295.

［33］ ALZAHRANI A S, ALSAADI R, MURUGAN A K, et al. TERT promoter mutations in thyroid cancer［J］. Horm Cancer, 2016,7(3): 165-177.

［34］ 唐新月, 石 峰, 黎翠林, 等. TERT启动子突变在甲状腺癌中的研究进展［J］. 中国临床药理学与治疗学, 2017, 22(3):350-354.